国自然经验贴：糖酵解的标书还能这样写？

来源：青椒医学
编辑：元素魔方科研服务

“研路漫漫，伴你同行”

糖酵解作为细胞能量转换的关键步骤，一直是国家自然科学基金研究的热门领域。那么，如何撰写一份能够突出项目重要性、创新性和实施可行性，从而脱颖而出的国自然申请书呢？今天，我们就以一个在2023年成功中标的糖酵解领域项目为例，向大家详细解读如何精心准备和撰写国自然申请书，帮助有志于此领域研究的学者们一窥项目申请书的撰写要领。

TIM-3/Galectin-9信号轴通过上调G6PC1抑制糖酵解导致

NK细胞抗头颈鳞癌免疫效应衰竭的机制研究

我们先分析一下这个项目：

TIM-3/Galectin-9信号轴：TIM-3（T细胞免疫球蛋白域3）和Galectin-9是免疫检查点分子和配体的一对，构成了一个重要的信号轴。TIM-3是一种位于免疫细胞表面的蛋白，而Galectin-9则是它的一个配体。这个信号轴在调控免疫应答中发挥重要作用，尤其是在肿瘤免疫逃逸机制中。当Galectin-9与TIM-3结合时，可以传递抑制信号，影响T细胞和自然杀伤（NK）细胞的功能，从而调节免疫反应。

G6PC1：G6PC1（葡萄糖-6-磷酸酶催化亚单位1）是葡萄糖-6-磷酸酶的一个亚单位，参与葡萄糖的生成过程（糖异生）。G6PC1在维持血糖平衡和能量供应中起着关键作用。

糖酵解：糖酵解是一系列酶促反应，通过这个过程，细胞可以在无氧（厌氧）条件下分解葡萄糖产生能量。糖酵解是细胞获取能量的重要途径之一。

NK细胞：自然杀伤（NK）细胞是人体免疫系统的一部分，属于非特异性免疫应答。它们能够识别并杀死受感染的细胞和肿瘤细胞，而不需要事先对特定抗原进行识别。

头颈鳞癌：头颈鳞癌是一种发生在头部和颈部区域（如口腔、喉、鼻咽等）的鳞状细胞癌。这种类型的癌症与烟草使用、饮酒和某些病毒（如HPV）感染有关。

免疫效应衰竭：指的是免疫系统对抗病原体或肿瘤的能力下降，导致无法有效清除外来侵害。在肿瘤免疫学中，这通常指的是T细胞或NK细胞等免疫细胞在长期与肿瘤细胞作战中变得功能低下。

通过上调G6PC1，TIM-3/Galectin-9信号轴抑制糖酵解过程，这种机制可能导致NK细胞的能量供应不足，从而导致NK细胞在抗头颈鳞癌中的免疫效应衰竭。换句话说，肿瘤细胞可能通过这种方式逃避NK细胞介导的免疫监视，促进肿瘤生长和扩散。此项目的研究分析着重于揭示这一调控机制，为开发新的肿瘤治疗策略提供了可能的方向。

针对这个项目，该如何撰写呢？

摘要

摘要撰写时注意其包括以下几个部分：

（1）疾病研究的问题（提出问题）；

（2）目前研究热点（问题切入）；

（3）预实验数据（提出假设的依据）；

（4）提出假设（根据研究热点和预实验数据，提出自己的科学假说，一句话）；

（5）拟进行研究（研究内容的缩写，打算怎么证明或验证假设）；

（6）研究意义。同时撰写时严格把控字符数在400以内。

根据以上几个要素，这里我们的摘要可以写为：

头颈鳞癌的发病率和死亡率居高不下，迫切需要开发新型治疗策略。尽管TIM-3/Galectin-9信号轴在多种肿瘤中的作用已被认识，但其在调控NK细胞功能方面的机制尚不明确，需深入探索。前期研究表明，TIM-3/Galectin-9轴能够影响NK细胞的代谢和免疫应答。特别地，我们观察到G6PC1在NK细胞中的表达受到该信号轴的上调。科学假说为：TIM-3/Galectin-9信号轴通过上调G6PC1，抑制糖酵解，导致NK细胞抗头颈鳞癌的免疫效应衰竭。本研究计划在组织样本水平、体内、体外和分子水平，借助流式细胞术、免疫组织化学和基因敲除等技术，明确TIM-3/Galectin-9信号轴对G6PC1表达的调控作用，阐释其抑制糖酵解进而影响NK细胞功能的机制，评价该信号轴在头颈鳞癌治疗中的应用潜力。该项目旨在揭示一个新的肿瘤免疫逃逸机制，为开发针对头颈鳞癌的新型免疫治疗策略提供理论基础和实验依据。

（一）立项依据

立项依据的撰写主要包括几个部分：

你要研究什么？即临床问题

研究的意义是什么？

目前的国内外研究有哪些缺陷，哪些问题，从何处入手？

我们在前期工作中发现了什么，即预实验，为什么我来研究这个问题最合适以及为何产生此假说？即阐明假说形成的思路过程。

凝练出本课题的关键科学问题，提出「研究假说」。简要说明你的研究思路。

在撰写立项依据时，参考文献也需要注意以下几点：

1. 选择权威和有影响力的文献；

2. 引用最新的研究成果：近3年，不可引用太老的文章，且需引用几篇申请当年发表的文献；

3 引用适量的文献：在立项依据中，不要过度引用文献，也不要过于依赖文献堆砌，青年、地区30篇左右，面上40篇左右即可。

此外，一个好的小标题能让专家在短时间内更直观地明确你的内容，标题的取法注意有逻辑、有层次，上下连贯，并阐明一个具体的结论而不是xxx的作用，xxx的影响之类的科普性语句

在这里，立项依据可以写做：

 1.1 针对头颈鳞癌新型治疗策略的迫切需求

在这部分中，应该详细描述头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的流行病学数据、当前治疗方法的局限性以及治疗失败的主要原因。强调研究新治疗策略的紧迫性，特别是面对复发或难治性病例时，新疗法的需求尤为迫切。

1.2 TIM-3/Galectin-9信号轴激活导致NK细胞免疫效应衰竭

此部分应阐述TIM-3和Galectin-9如何在NK细胞中相互作用，并导致NK细胞功能抑制或免疫耗竭。介绍已有的研究结果，说明这一信号轴激活时NK细胞的活性和杀伤功能如何被降低，从而在癌症免疫逃逸中发挥关键作用。

1.3 TIM-3/Galectin-9信号轴上调G6PC1表达

解释TIM-3/Galectin-9信号轴如何通过上调G6PC1来调节细胞的功能。讨论G6PC1表达增加如何可能影响NK细胞以及其他免疫细胞的代谢状态和免疫应答。

1.4 G6PC1的上调抑制糖酵解影响NK细胞能量代谢

深入探讨G6PC1的表达上调如何通过抑制糖酵解过程来影响NK细胞的能量代谢。阐述这种代谢改变如何减少NK细胞的能量供应，进而影响其对肿瘤细胞的监视和杀伤能力。

1.5 本项目的科学假说和后续研究计划

在这最后一部分，明确提出基于以上背景信息和现有证据形成的科学假说。概述后续研究的具体目标和计划，包括预期的实验设计、使用的技术方法以及如何通过这些研究进一步验证假说，并探索新的治疗途径。

（二）项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题

2.1 研究目标

研究目标的撰写注意以下几点

1.目标清晰，层次分明，只写目标，不用再重复研究意义、用什么方法研究，且目标具体，可实现。

2. 突出科学性。

3.内容详尽，覆盖到所有的拟解决的科学问题。

可按照明确……关系；揭示……规律；理解……作用；阐明……机制等的模板撰写

以本项目为例，研究目标可写做：

1.明确TIM-3/Galectin-9信号轴与G6PC1表达之间的调控关系，为解析其在NK细胞能量代谢中的作用奠定基础。

2.揭示G6PC1上调对NK细胞糖酵解抑制及能量供应不足影响的分子规律，深入理解NK细胞功能衰竭的代谢基础。

3.理解抑制糖酵解如何导致NK细胞抗头颈鳞癌免疫效应衰竭的详细机制，探索新的肿瘤免疫治疗策略。

2.2 研究内容

研究内容的撰写需注意是为了达成研究目标而要去做的研究，与研究目标呼应，为具体研究方案的框架，撰写过程中可按照临床样本、动物水平、细胞水平分层次撰写，阐明做什么事达成什么目的。同时明确细胞、动物模型的选择和构建

那么，研究内容撰写为：

1.临床研究部分

通过收集头颈鳞状细胞癌（HNSCC）患者的血液和肿瘤组织样本为研究对象，本研究旨在探讨TIM-3/Galectin-9信号轴对NK细胞功能的影响。每组至少包括30名患者。使用免疫组化（IHC）技术和流式细胞仪分析TIM-3和Galectin-9的表达水平。此外，通过qRT-PCR和西方印迹（Western Blot）技术检测G6PC1表达，以及细胞内糖酵解相关酶活性，评估TIM-3/Galectin-9信号轴在调控NK细胞抗肿瘤功能中的作用机制。

2.动物实验部分

以转基因敲除TIM-3的裸鼠模型为动物疾病模型，通过CRISPR/Cas9技术构建。选用人头颈癌细胞系（如SCC-25和FaDu）接种到动物中，构建肿瘤生长模型，分为敲除TIM-3组和对照组，每组15只。应用免疫组化和TUNEL染色检测肿瘤组织中NK细胞的浸润情况和凋亡状态，同时通过Edu增殖实验评估NK细胞的增殖能力。此外，通过ELISA技术检测血清中炎症因子的水平，如IFN-γ和TNF-α，来评估NK细胞的活性和抗肿瘤效应。

3.细胞实验部分

利用NK细胞系（如NK-92和KHYG-1）和头颈癌细胞系进行体外实验。通过RNA干扰技术（RNAi）和CRISPR/Cas9技术特异性敲降TIM-3和Galectin-9的表达，观察其对NK细胞抗肿瘤功能的影响。细胞实验将分为对照组、TIM-3敲降组、Galectin-9敲降组和双重敲降组。应用细胞培养、细胞增殖和凋亡检测技术评估NK细胞的增殖和死亡率。通过免疫共沉淀（CO-IP）和免疫荧光技术研究TIM-3与Galectin-9之间的相互作用及其对NK细胞功能的影响。最后，利用定点突变技术创建TIM-3和Galectin-9的功能性突变体，进一步揭示其在NK细胞抗肿瘤免疫中的作用机制。

4.分子机制研究部分

结合前述实验数据，进一步深入研究TIM-3/Galectin-9信号轴通过调节G6PC1抑制糖酵解的具体分子机制。通过高通量蛋白质组学和转录组学分析，识别与TIM-3/Galectin-9信号轴相关的上下游调控因子。使用CHIP-seq和ATAC-seq技术分析TIM-3和Galectin-9在NK细胞中的直接靶基因和表观遗传调控网络。此外，通过荧光共振能量转移（FRET）和表面等离子共振（SPR）技术进一步验证TIM-3与Galectin-9之间的物理相互作用，以及这种相互作用如何调节NK细胞的糖酵解过程和抗肿瘤活性。通过这些研究，旨在全面揭示TIM-3/Galectin-9信号轴在NK细胞免疫监视中的作用机制，并为开发新的免疫治疗策略提供理论基础。

2.3 拟解决的科学问题

关键科学问题的撰写需要凝练出本项目的重点难点问题，同时与研究目标、研究内容相呼应，使得研究目标就是去解决这个问题，而研究内容就是解决这个问题的方式。撰写中在提出科学问题之后还要解释一下为什么这是关键科学问题；并给出解决方案，如何去解决这个问题。

在青年、地区项目中，关键科学问题通常写2个即可，面上则撰写3个为宜。

具体如何撰写呢？

1.明确TIM-3/Galectin-9信号轴对NK细胞糖酵解过程的具体影响是本项目拟解决的关键科学问题之一。

这一问题关键在于，虽然已知TIM-3/Galectin-9信号轴在调节免疫细胞功能中起着重要作用，但其如何精确调控NK细胞的能量代谢和糖酵解过程，尤其是通过G6PC1，仍不明确。本项目拟通过流式细胞术和细胞代谢分析实验，包括糖耗量和乳酸产生测定，以及ATP测量实验，证实TIM-3/Galectin-9信号轴对糖酵解的影响。

2.阐明G6PC1上调如何导致NK细胞免疫功能衰竭是本项目拟解决的关键科学问题之二。

该问题的创新性在于揭示一个新的代谢调控机制，即G6PC1在NK细胞中的作用及其对NK细胞抗肿瘤功能的影响。本项目将通过基因敲除和过表达技术结合NK细胞活性评估（如细胞毒杀能力测试和细胞因子分泌分析），以及糖酵解关键酶活性的变化，来解决这个问题。

3.揭示TIM-3/Galectin-9信号轴及G6PC1在头颈鳞癌治疗中的潜在作为临床靶点的价值是本项目拟解决的关键科学问题之三。

这个问题的深度在于，通过理解信号轴在调控NK细胞功能中的作用，可以为头颈鳞癌的免疫治疗提供新的策略。本项目拟通过临床样本分析（IHC和qPCR）评估TIM-3、Galectin-9和G6PC1的表达水平，结合小鼠头颈鳞癌模型，通过实验观察NK细胞介导的肿瘤抑制效果，以及TIM-3/Galectin-9信号轴抑制剂和G6PC1激活剂的治疗潜力，证实其作为临床靶点的价值。

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