简述昆虫细胞系统的蛋白表达与纯化

1.重组蛋白昆虫细胞表达的原理

重组蛋白昆虫细胞表达系统以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为宿主，进行基因组自我扩增并且完成目的蛋白表达，被广泛用于生物研究领域[1]。

该表达系统的原理主要包括病毒侵染昆虫细胞（如：SF9细胞和SF21细胞）、病毒DNA复制、外源基因插入和表达等步骤[2]。昆虫杆状病毒通过其表面的受体与昆虫细胞表面受体结合并进入细胞，病毒DNA被释放并复制，形成大量的病毒DNA分子。并通过同源重组等方法将外源基因插入到病毒DNA中，外源基因随着病毒DNA的复制而复制，并在细胞内表达出外源蛋白。

图1：使用FlashBAC™和MultiBac™方法生成重组杆状病毒的过程[3]   

1.  昆虫细胞的选择

第一个永生化的昆虫细胞系是在1960年代建立的，之后陆续已经从许多不同昆虫中建立了数百种昆虫细胞系，部分细胞系用于表达重组蛋白，用于基础研究，部分昆虫细胞系现在被用于制造生物制品。昆虫细胞系经常被外源病毒污染，已经发现一种或多种外源病毒与常规用于重组蛋白表达的所有细胞系有关。只有在经过严格的实验后，进行适当的阳性和阴性对照，才能认为昆虫细胞系不含外源病毒。

最常用于重组蛋白表达的昆虫细胞系来源于鳞翅目（飞蛾和蝴蝶）和双翅目（苍蝇）。昆虫细胞广泛用于重组蛋白表达，通常作为重组杆状病毒载体的宿主，也用于质粒介导的瞬时转染或稳定的基因转化，SF9和Sf21细胞是昆虫细胞表达系统的常用宿主细胞。

1. 目的基因体外重组到病毒基因组的常用方法

目的基因体外重组到病毒基因组的商业化系统比较少，常见的是BaculoDirect系统。该系统结合Gateway克隆技术，将attR序列整合到线性化的杆状病毒基因组中，而供体质粒上目的基因两侧带有attL序列。将初步克隆与BaculoDirect线性DNA和Gateway LR Clonase酶混合后孵育，转染至Sf9或Sf21昆虫细胞即可进行重组病毒的制备[4]。该系统的优点是方便快速，但缺点显而易见，需要实验室配套Gateway克隆生态，成本较高。

4.重组蛋白昆虫表达的优势

（1）表达产物在结构及功能上接近天然蛋白，生物学功能完整；

（2）昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰作用[3]（如糖基化、磷酸化、乙酰化等）；

（3）昆虫细胞可进行悬浮培养，且容易在无血清培养基中存活，易实现大规模低成本生产；

（4）杆状病毒毒粒可扩大，能包装大的基因片段；

（5）BEVS在动物病毒VLP研究中应用广泛，由其生产的疫苗在医药审批程序上有望通过绿色通道获得更快的审批途径。 

参考文献

1. Kong M, Zuo H, Zhu FF, et al. The interaction between baculoviruses and their insect hosts. Dev Comp Immunol, 2018, 83: 114–123. DOI: 10.1016/j.dci.2018.01.019
2. Liu YP, Wang FH, Sun ZJ, et al. Progress of studies and application on baculovirus expression vector system. Chin Bull Entomol, 2006, 43(1): 1–5. (in Chinese).

[3] Mckenzie E A , Mark Abbott W .Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells[J].Methods, 2018:S1046202317303900.DOI:10.1016/j.ymeth.2018.05.013.

[4] Blissard GW, Rohrmann GF. Baculovirus diversity and molecular biology. Annu Rev Entomol, 1990, 35: 127–155. DOI: 10.1146/annurev.en.35.010190.001015