操作步骤
- 取15ml的研磨器,加入血块样本后,再加入4-5ml的溶血试剂,研磨至血块消失后再研磨2-3min,然后移入到15ml离心管中;3000rpm,离心10min。
- 离心结束后,弃去上层液后,加入8-10ml的溶血试剂,使用一次性滴管将沉淀吹打均匀;3000rpm,离心10min。
- 待离心结束后,弃去上层液,再加入1ml溶血试剂,使用微呈移液器将沉淀吹打均匀,转移至2ml的EP管中;6000rpm,离心10min。
- 弃去上清液,加入1ml细胞裂解液,将沉淀震荡均匀后,每个离心管加入10ul的蛋白酶k(20mg/ml),37°C恒温水浴过夜,或者是56°C水浴3小时。
- 水浴结束后,在通风橱内,每管加入1ml(等体积)平衡酚,上下颠倒混匀50次后,6000rpm,离心10min。离心结束后,吸取上清与另一个2mlEP管(水相含有DNA,白色絮状物为蛋白)。
- 重复步骤5 吸取上清与一个2mlEP管,然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)I上下颠倒混匀50次,6000rpm,离心10min。
- 吸取上清液与另一个1.5mlEP管中,加入100ul3MNaAc(ph=5)轻轻混匀后,再加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇,上下颠倒混匀150次,混匀时的动作要轻柔,混匀结束后可见白色的絮状物(即为DNA),10000rpm,离心5min。
- 弃去上清液,加入350-500ul无水乙醇,轻轻振洗,然后10000rpm,离心5min,(如在去除酒精的时候,DNA沉淀有悬浮,可以加大离心的转速),将酒精倒掉,把EP管放在通风橱中风干。(一般约两小时即可,如没有完全风干,可以适当的延长时间)。
- 待DNA风干后,加入TE100ul,在4°C冰箱中存放约十天后,使用紫外分光计检测DNA的浓度和纯度,依据所测浓度稀释分装,分装完成后将三种液体置于-20"C的冰箱中保存备用。
所用器材
高速离心机
涡旋振荡器
水浴锅
烘箱
冰箱
微量移液器10ul.100ul.1000ul.
高压灭菌锅
离心管:15ml、2ml、1.5ml、1.0ml、0.5ml
一次性塑料滴管
15ml玻璃研磨器
试剂
溶血试剂,细胞裂解液,蛋白酶-K。
平衡酚,氯仿/异戊醇,醋酸钠,异丙醇,无水乙醇,TE缓冲液。
10%SDS、1M NaCI、0.5M EDTA、lM Trisbase-Hcl
十二浣基硫酸钠(SDS)
三经甲基氨基甲浣(Tris)
乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、MgCl2
曲拉通X-100:辛基苯基聚氧乙烯醚
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