OD值定量细菌悬浮液原理和注意事项

引言
微生物定量的常用方法可以大致的分为计数法和比浊法。计数法的依据是通过取部分样品，稀释，计数，之后换算成待测样品的一种方法。比浊法主要是通过OD值进行反映，具体下文中会讲到。这两种方法很难说优劣，其实在实际操作过程中都搭配着使用，相互有各自的适用范围，使得到的结果更精确。本篇的讲述主要适用于比浊法。

1、原理介绍
在微生物的定量分析中，通过OD值反映微生物的浓度或数量是一种常用的方法。很多文章都提到其原理是细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成正比，与光密度成反比。它的理论依据为光吸收的基本定理——朗伯比尔定律。

2、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔定律（Beer-Lambert Law）是光吸收的基本定律，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是比色分析及分光光度法的理论基础。光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。A=lg(1/T)=Kbc

3、问题：细菌悬浊液适用于朗伯-比尔定律的成立条件？
朗伯-比尔定律成立条件是待测物为均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射。但细菌、细胞等相关的物质并不属于稀溶液和气体的范畴。为什么还用OD值反映微生物的浓度呢？

4、点成小讲堂
虽然朗伯-比尔定律是一个有限的定律，但一定浓度下，菌悬液可以看成是溶液，将内部的细菌当做均一粒子。有诸多文献表明，在一定范围浓度内，该阶段的光密度跟菌体的浓度成正比。

具体来讲，细菌菌液不能直接适用于朗伯比尔定率，只是因为细菌是粒状的物体才会跟朗伯比尔定律的这种方法关联且部分有效。注意是部分哈。可以把这种方法看成在一些限定条件下的半经验方法，这个限定条件就是微生物处于线性生长期。

类似理想气体状态方程虽然有诸多的限制条件，但若在误差的允许范围内，也是可以用来估算气体状态的。

5、操作注意事项：

回答完以上问题，可知，微生物的定量分析并不是像我们想的那样，把试管一放，仪器一按，就可以得到答案的。下面就为您解答，整个拿到一份未知浓度的细菌培养液，怎样用OD值进行定量分析吧。

1：怎样选最适合的波长？
答：一般都采用550-650，其实如果波长一定的话，即之后做标准曲线也是当时测量的波长的话，基本没什么影响。

2、如果菌液超出该菌种浓度的适用范围呢？
答：稀释。同行们有个0.2-0.7的说法，但具体如何，感觉也和微生物种类有很大关系，反正如果太浓的话，一定要稀释就对了。

3、做完以上步骤，测完OD值，你就知道该菌液的微生物数量了？
答：还没有。还存在2个问题

• 测量OD值的结果反映一般只是总菌数。在对数生长期时，OD值和活菌数呈现一定的线性关系，但稳定期时，细菌的一部分在生长，一部分已经死亡，此时反映的只能是总菌数的增多，但活菌数却无法反映。
• 当菌体较为规则，菌群分布较为均匀，干扰OD测量的因素较少，但对于菌体过大或丝状菌体悬液，如丝状真菌，则会因为分布均匀度及折射反射影响光吸收等问题导致测量结果不准确。
• **解决方案：**一般行业中，有估算1 OD=10^8 cells/ml。但是还需要结合具体的菌种，这里推荐方法可以提前测量一下该菌种的标准曲线或得到一个相关的方程式。横坐标是OD值，纵坐标该微生物较权威的计数指标，采用显微镜计数、涂板菌落计数等，或者流式细胞仪都行。之后你和换算即可得到菌液的微生物数量了

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