浅谈基因敲除技术

基因敲除背景

基因敲除技术是一种通过精确操作基因组，使特定基因失活或删除的分子生物学技术。其核心原理是利用核酸内切酶如CRISPR-Cas9系统、TALEN（转录激活因子效应物核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）等工具，识别并切割目标DNA序列，从而实现对基因的定点编辑。

基因敲除方法

（1）同源重组

同源重组（HR）是细胞内一种修复DNA双链断裂（DBS）的机制，修复发生在非姐妹染色单体之间或者同一染色体之间含有同源序列的DNA分子之间。HR介导的DSB修复过程包括三个主要步骤：1末端切除，在DSB两端的5'端进行切除，产生3'单链DNA（ssDNA）尾，由多个核酸酶和辅助蛋白共同完成；2DNA链侵入，3'单链DNA尾侵入同源双链DNA，形成D-loop（位移环）；3Holliday结构的解析，在多种酶的作用下完成DNA的合成、修复和连接，产生产生交叉（CO）和非交叉（NCO）修复产物，最终恢复完整的染色体结构。此外，RNA聚合酶III（RNAPIII）定位到DSB位点、合成RNA链，形成RNA-DNA杂合链保护3'单链DNA（ssDNA）突出端、参与长距离末端切除。

（2）RNA干扰（RNAi）

RNAi技术是一种在分子生物学领域中非常重要的基因沉默技术，双链RNA(dsRNA)被Dicer酶切割成小片段RNA，称为小干扰RNA(siRNA)。siRNA由正义链和反义链组成，反义链siRNA与Ago蛋白结合形成RISC沉默复合物，siRNA基于碱基配对原则驱动RISC识别并剪切靶mRNA，导致mRNA降解，从而阻止了目标基因的翻译，实现基因沉默。

（3）CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9系统源自细菌和古菌，由Cas9蛋白和sgRNA组成，Cas9蛋白具备切割DNA双链的功能，而sgRNA引导Cas9识别目标DNA序列。Cas9酶切割靶DNA序列产生DBS，在通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）修复DSB，引入突变或替换碱基序列，造成基因沉默，功能丧失，实现基因敲除。

基因敲除技术的应用

基因敲除技术，在生物学研究方面，可以揭示基因对生长、发育代谢等生理过程的作用；在疾病治疗方面，可以敲除与疾病相关的基因，模拟疾病发生机制，可以更快提出治疗方案；在农业生产方面，利用基因敲除技术可以改良农作物的性状，如抗旱、抗寒、抗病、高产等。

基因敲除的技术问题

（1）RNAPIII在HR中的功能

RNAPIII是HR介导的DSB修复的关键因子，负责催化RNA-DNA杂合链中RNA链的合成，且由MRN复合物招募到DSB位点，其功能异常会抑制HR、影响末端切除并导致遗传损失。

（2）siRNA药物的作用

通过设计特异性siRNA，可以实现对某些致病基因的敲除，抑制相关基因的表达。siRNA可应用于基因功能研究、基因治疗、药物筛选、农业生物技术等领域。

参考文献

[1]Liu, S,J. (2019). RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination.Cell.184(5):1314-1329.

[2].Zhu, P,H., Luo, Q., Wang, Y,F., Feng, B. (2018). Gene editing mediated by homologous recombination and non-homologous end joining repair pathways: cognition, application and prospect of CRISPR technology. Life Sciences.30:09.

[3]Zhou H, Xia XG, Xu Z. (2005). An RNA polymerase II construct synthesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator and mediates highly efficient RNAi. Nucleic Acids Res. 33(6):e62.