Hands-on: Exome sequencing data analysis for diagnosing a genetic disease / Exome sequencing data analysis for diagnosing a genetic disease / Variant Analysis
Exome sequencing data analysis for diagnosing a genetic disease
1. 数据准备
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- 测序数据通常是高通量测序仪生成的 FASTQ 文件，里面包含了成千上万个 DNA 碱基片段（reads），每个片段都有它的碱基序列和测序质量分值（Phred 分值）。
- 为什么需要质量控制？
测序过程可能因为技术问题导致错误，比如某些片段测序不完整或错误读出碱基。这些低质量的数据如果直接进入分析流程，可能会导致错误的变异检测结果。 - 质量控制步骤：
通过工具（如 FastQC）查看每个样本的碱基质量分布、GC 含量和序列长度。如果发现低质量序列（Phred 分值低于 20 或 30），需要用 Trimmomatic 等工具剪切或去除。
通俗类比
- 数据准备就像在图书馆拿到一本书之前，先检查书页是否完整。如果有破损的页面，就需要先修复或更换。
2. 对齐序列
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- 目的：
将测序的 DNA 片段（reads）正确地匹配到参考基因组上的对应位置，这样才能识别样本中与参考的差异。 - 对齐工具：
本教程推荐 BWA-MEM，它是一种高效的比对算法，可以处理短读长和长读长数据。- BWA-MEM 会根据每个 DNA 片段的序列特点，找到它最有可能匹配的位置，并计算比对得分（alignment score）。
- 如果一个片段匹配多个位置（重复区域），得分最高的位置将作为最佳匹配。
- 结果文件（BAM 文件）：
BAM 文件是对齐结果的压缩格式，里面记录了每个片段的位置、比对质量等详细信息。
通俗类比
- 对齐序列就像把一页散落的拼图按正确的顺序拼回到原来的图案上。参考基因组就是这个图案的模板。
3. 变异检测（FreeBayes 工具）
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- FreeBayes 的特点：
这是一种基于贝叶斯统计模型的工具，专门用于检测基因组上的多种变异类型。它不仅能检测单碱基变异（SNP），还可以识别小的插入（Insertion）和缺失（Deletion）。 - 分析原理：
FreeBayes 会从对齐的 BAM 文件中读取每个位置的碱基信息，并根据每个碱基的频率、质量和支持的片段数量来评估变异是否存在。- SNP：某个位置的碱基与参考基因组不同。
- Indel：某个位置有额外的碱基插入或缺失。
- 参数设置：
用户可以调整变异检测的参数，比如最小支持深度（minimum depth）和最小质量阈值，以减少假阳性结果。
通俗类比
- 使用 FreeBayes 就像用放大镜观察一本书的每一个字母，检查哪些字母跟原来的标准文本不一样。
4. 数据过滤与注释
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- 过滤：
检测出的变异可能有误，比如由于测序错误导致的假阳性。因此，需要通过设定质量分值（QUAL）和深度（Depth）的阈值，剔除低可信度的变异。 - 注释：
通过工具（如 SnpEff 或 VEP），为每个变异添加生物学信息，包括：- 变异的位置（是否在外显子区域或调控区域）。
- 变异对蛋白的影响（是否改变了氨基酸序列）。
- 是否与已知的疾病或功能相关。
- 输出：
注释完成后会生成一个新的变异文件，里面包含每个变异的详细描述和可能的生物学意义。
通俗类比
- 过滤和注释就像对发现的错别字进行分类，判断哪些是真的错误，哪些可能是作者的特殊用法，同时标注这些错字对故事理解的影响。
5. 分析与可视化
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- 工具：
IGV（Integrative Genomics Viewer）是一种常用的基因组浏览工具，可以让用户直观地查看每个变异的位置和周围的上下文信息。 - 查看内容：
- 是否有足够的测序深度支持检测到的变异。
- 变异附近是否有结构复杂的区域（如重复序列）。
- 变异是否可能与其他区域的变异有关。
- 可视化：
可以生成覆盖深度图和序列比对图，帮助验证结果的可靠性。
通俗类比
- 分析与可视化就像在地图上标出所有的异常位置，然后用放大镜仔细检查每个位置，看看是不是有问题。
二 框架
文献名称
- 英文原名：Exome Sequencing and Variant Analysis with Galaxy
- 中文翻译：使用 Galaxy 平台进行外显子组测序和变异分析
1. 基本信息
1.1 文献名称
- 英文：Exome Sequencing and Variant Analysis with Galaxy
- 中文：使用 Galaxy 平台进行外显子组测序和变异分析
1.2 期刊名称，期刊最新影响因子，发表日期
- 期刊名称：Galaxy Project Tutorial
- 最新影响因子：无，属于开源教学材料
- 发表日期：2023 年（假设年份，具体可确认）
1.3 作者及通讯作者单位
- 作者：Galaxy Project
- 单位：Galaxy 项目组
1.4 链接
1.5 PMID 编码
- 无 PMID 编码
1.6 关键词
- 外显子组测序：通过高通量测序技术，专注分析基因组中的外显子区域，检测基因变异。
- 变异分析：寻找 SNP 和 Indel 等基因组上的结构变化，理解它们的生物学意义。
- FreeBayes：一种基于贝叶斯模型的变异检测工具，专注于单核苷酸变异（SNP）和小插入/缺失（Indel）。
- Galaxy 平台：一个开放、可视化的生物信息学分析平台，支持多种分析流程，无需编程经验。
2. 文章概述
2.1 目的
- 教授如何利用 Galaxy 平台和 FreeBayes 工具，从外显子组测序数据中检测基因变异，掌握完整分析流程。
2.2 方法
- 使用高质量测序数据（FASTQ 格式），结合 Galaxy 提供的图形化工具（如 BWA、FreeBayes 和 SnpEff），完成数据质量控制、比对、变异检测和注释。
2.3 结果
- 生成变异文件（VCF 格式），并通过可视化工具（如 IGV）验证检测到的变异。
2.4 结论
- Galaxy 平台提供了一个简化的外显子组分析流程，使科研人员能够快速开展变异研究。
3. 研究背景 / 引言
What is known
- 外显子组测序专注于基因组中功能性区域，是发现致病性基因变异的重要技术手段。
- 传统的变异检测工具要求编程技能，限制了许多研究人员的使用。
What is new
- 本教程通过 Galaxy 平台，将复杂的变异检测流程图形化，使无编程经验的用户也能轻松完成外显子组分析。
What are the implications
- 降低学习门槛，推动变异分析在基因组学研究和临床应用中的广泛普及。
4. 研究思路
4.1 提出研究问题
- 如何用一个无编程经验的平台完成外显子组变异检测？
4.2 构建研究框架
- 数据准备（FASTQ 数据）
- 序列比对（BWA-MEM）
- 变异检测（FreeBayes）
- 数据注释（SnpEff）
- 结果验证（IGV）
4.3 选择研究方法
- 采用开放的 Galaxy 平台，配合多种经典工具。
4.4 分析数据
- 使用变异检测工具识别基因组差异，注释其功能。
4.5 得出结论
- 本教程为变异分析提供了用户友好的解决方案。
5. 研究结果
- 逻辑重点：验证 Galaxy 平台在外显子组变异分析中的实用性。
- 表型：检测到多个与疾病相关的 SNP 和 Indel。
- 机制：基于参考基因组的变异定位与注释。
- 回补：通过工具验证结果的准确性。
6. 研究结论与讨论
6.1 研究结论
- 使用 Galaxy 平台和 FreeBayes，可实现无编程背景的外显子组变异分析。
6.2 研究的创新性
- 图形化流程降低技术门槛，适用于多学科研究人员。
6.3 研究的不足之处
- 仅限于外显子区域，可能遗漏基因组其他重要变异。
6.4 研究展望
- 未来可将流程扩展至全基因组测序（WGS）分析，增加功能区域覆盖。
6.5 研究意义
- 推广生物信息学分析技术，加速疾病基因研究和精准医学发展。
三 galaxy基本介绍
3.1 主页
1
https://training.galaxyproject.org/training-material/workflows
3.2 Galaxy 平台目录：服务器、云和可部署资源 - Galaxy Community Hub --- Galaxy Platform Directory: Servers, Clouds, and Deployable Resources - Galaxy Community Hub/use/
Galaxy已整合了多个分析流程的开源工具，通过其网站即可访问使用，进入
，在UseGalxy页面下是官方服务器，
点击The Galaxy Project free public server;----biomedical research的Server，即可进入免费公共的Galaxy分析平台，我选择NGS:RNA Analysis进入HISAT2分析界面，如下所示：
Galaxy_official
除了流行的分析软件，还有一些文本处理工具（勉强适合一些常规需要，毕竟大家的需求都是多样化的。。。）
除了官方的Galaxy Server外，还有一些团队/个人基于Galaxy开发的公开分析平台，可以在上述网站的Public Servers界面下找到，可以通过一些关键词找到你所需要的分析流程，如搜索proteomics，如下所示：
Galaxy_public
从中可看出Galaxy可以用于搭建定制化的生信分析平台，这点就很有意思了，其主要是提供一个平台框架，而管理员则是需要在这个平台上添加分析工具即可供他人使用，主要还是开源的。。。
image.png
开始使用 - Galaxy 社区中心 --- Get Started - Galaxy Community Hub
比如，这里找了个Metabolomics workflow：
https://galaxyproject.org/use/workflow4metabolomics/
比如，这里找了个Metabolomics workflow：
https://galaxyproject.org/use/workflow4metabolomics/
更多详细的资源在这个界面，旁边有非常多的工具
没用过，现在也不知道怎么用，尤其是部署自己的服务器，对Galaxy平台进行本地化搭建，貌似有些麻烦，后续有机会摸索。
此外，在Github上收集了不少Galaxy Training的内容，资源不是一般多，关键怎么利用的问题。https://galaxyproject.github.io/training-material/
仅仅Proteomics就有一系列内容https://galaxyproject.github.io/training-material/topics/proteomics/
实操
WES学习2：外显子测序分析——小男孩的硬骨化病基因突变_wes测序,预测突变基因与疾病关系,生信怎么做-CSDN博客
refer：
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