肝类器官培养全流程：从原代到冻存与复苏

肝类器官培养技术在生物医学研究和再生医学中具有广泛的应用价值。本文将从原代细胞的分离、类器官的传代培养、冻存及复苏四个方面，介绍标准实验流程。

1. 原代细胞分离

原代细胞的分离是类器官培养的关键第一步，直接影响后续培养的质量与实验结果。

1.1 组织采集与前处理

• 取材后的正常肝组织需在 2 - 8℃ 低温条件下迅速转运至实验室。

• 记录样本信息，并进行拍照存档。

• 在洁净实验室中，将组织放入4℃ 预冷的原代培养缓冲液 B，清洗三次以去除杂质。

1.2 组织剪切与消化

• 用眼科剪或手术刀去除肝粘膜，并剪切成 1~3 mm³ 组织块。

• 组织块置于正常肝原代组织消化液 C中，37℃ 震荡消化 15-20 min，实时观察消化进程。

• 通过显微镜观察，发现较多单个细胞或70μm 以下的细胞簇时，加入三倍体积的原代培养缓冲液 B 终止消化。

1.3 细胞分离与铺板

• 过滤消化产物（100μm 筛网），收集滤液后以300g 离心 5 min。

• 观察收集的细胞体积，并按照 1:25 的比例添加基质胶混匀。

• 取 24 孔培养板，每孔加入 25μl 组织基质胶混合物，并在 4℃ 下铺板。

• 培养板置于37℃ 培养箱中 10-15 分钟形成凝胶后，加入正常肝类器官培养基 A培养。

2. 类器官传代培养

类器官传代培养确保类器官的长期维持与扩增。

2.1 传代前处理

• 移除培养基，每孔加入1-2ml 4℃ 类器官传代培养缓冲液 G，静置 2 min。

• 轻柔吹打基质胶，收集类器官至15ml 离心管，4℃ 静置 10 min。

2.2 传代策略

• 类器官数量不足或体积较小时

  • 300g 离心 5 分钟，去上清。

  • 添加适量类器官传代培养缓冲液 G重悬，并移入 1.5ml 离心管，继续离心去除液体。

• 类器官数量较多或体积较大时

  • 先消化 2-3 min，再用类器官传代培养缓冲液 G终止消化。

  • 经过两次离心去上清后，重悬并铺板培养。

2.3 重新铺板培养

• 添加基质胶重悬，每孔 25μl 细胞基质混合物。

• 37℃ 培养 10-15 min形成凝胶，加入500μl 正常肝类器官培养基 A。

3. 类器官冻存

长期存储类器官需要使用特定的冻存技术，以保持细胞的活性和功能。

3.1 冻存操作

• 吸去培养基，每孔加入 1-2ml 4℃ 类器官传代培养缓冲液 G，静置 2 min。

• 轻柔吹打基质胶，收集类器官至 15ml 离心管，4℃ 静置 10 min。

• 300g 离心 5 min去除上清后，添加适量类器官冻存液 F轻柔重悬。

• 以 2 孔类器官/管 的密度冻存，每管1.4ml。

3.2 冻存条件

• 贴好标签信息后，进行程序降温，随后移入液氮长期保存。

4. 类器官复苏

冻存的类器官可通过标准化复苏流程恢复活力。

4.1 复苏步骤

• 取 10ml 类器官传代培养缓冲液 G 于 15ml 离心管中备用。

• 从液氮中取出冻存管，立即置于 37℃ 水浴锅 中融解。

• 1-2 min内 轻柔摇动冷冻管，确保冻存液完全融解。

• 迅速转移至 15ml 离心管，轻轻吹打混匀后300g 离心 5 min。

• 取出沉淀物，重悬并进行24 孔培养板铺板。

4.2 培养恢复

• 铺板后置于 37℃ 培养箱 10-15 min形成凝胶。

• 添加 500μl 正常肝类器官培养基 A，开始类器官培养。

肝类器官的培养为肝病研究、药物筛选和再生医学提供了有力工具。本文详细介绍了原代细胞的分离、传代培养、冻存及复苏的标准化流程，希望为相关领域的研究人员提供指导与参考。