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Single-cell transcriptomic analysis defines the interplay between tumor cells, viral infection, and the microenvironment in nasopharyngeal carcinoma
本文是一篇临床研究文章，题为 “单细胞转录组分析确定了鼻咽癌中肿瘤细胞、病毒感染和微环境之间的相互作用”。该研究旨在利用单细胞RNA测序了解鼻咽癌（NPC）中肿瘤细胞、Epstein-Barr病毒（EBV）和微环境之间的相互作用。
研究人员对来自鼻咽癌样本和非恶性鼻咽活检组织的10万多个细胞进行了转录组分析。他们在鼻咽癌的多细胞生态系统中发现了**干扰素反应的全面上调，并在恶性细胞中发现了与不良预后相关的上皮-免疫双重特征**。
功能实验表明，具有这种双重特征的肿瘤细胞具有更强的肿瘤发生能力和免疫抑制能力。这项研究为了解鼻咽癌的多细胞生态系统提供了新的视角，具有重要的临床意义。
一、摘要
研究人员对来自 19 例 EBV 阳性鼻咽癌和 7 例非恶性鼻咽活检组织的约 104,000 个细胞进行了单细胞 RNA 测序。他们同时分析了恶性细胞、EBV、基质细胞和免疫细胞的转录组。
研究结果表明，在鼻咽癌的多细胞生态系统中，干扰素反应出现了全局性上调。干扰素是一种蛋白质，在针对病毒感染和肿瘤的免疫反应中起着至关重要的作用。这种上调表明，免疫系统因鼻咽癌的存在而被激活。
重要的是，研究人员在恶性细胞中发现了与不良预后相关的**上皮-免疫双重特征。这种双重特征表明，恶性细胞同时具有上皮细胞（排列在身体表面和腔内的细胞）和免疫细胞的特征**。功能实验证明，具有这种双重特征的肿瘤细胞具有更强的肿瘤发生能力，表明它们形成肿瘤的能力更强。
对肿瘤微环境（TME）及其与肿瘤细胞相互作用的进一步分析表明，肿瘤细胞的双重特征与 CD8+ 肿瘤浸润 T 细胞上共抑制受体的表达呈正相关。共抑制受体是一种调节免疫反应的分子，可以抑制 T 细胞的活性。这一发现表明，具有双重特征的肿瘤细胞有能力抑制 TME 中的免疫反应。
此外，具有双重特征的肿瘤细胞还能**抑制T细胞产生γ干扰素（IFN-γ）。IFN-γ 是一种重要的细胞因子，有助于激活免疫细胞并增强其消灭癌细胞的能力。具有双重特征的肿瘤细胞抑制 IFN-γ 的产生，进一步证明了它们的免疫抑制**能力。
总之，这些发现为了解鼻咽癌复杂的多细胞生态系统及其与免疫系统的相互作用提供了新的视角。在预后不良的恶性细胞中发现双重特征及其与免疫抑制的相关性，凸显了这些发现的潜在临床意义。了解鼻咽癌中免疫逃避和肿瘤进展的机制有可能开发出改善患者预后的靶向疗法。
二、引言
鼻咽癌是一种源于鼻咽上皮细胞的头颈部癌症。它最常见于中国南部和亚洲东南部。Epstein-Barr 病毒（EBV）是一种属于γ-疱疹病毒家族的疱疹病毒，被认为是鼻咽癌的致病因素。EBV 编码的一些基因会导致鼻咽癌的发生和发展。例如，LMP1 可激活宿主细胞中的信号通路，促进细胞增殖并抵抗细胞凋亡。
以往的研究侧重于了解鼻咽癌的肿瘤发生和分子基础，包括易感基因、基因组改变、基因表达模式以及宿主与病毒之间的相互作用。然而，这些研究大多采用从大块角度研究肿瘤的方法，这**限制了它们分析肿瘤内异质性（ITH）和肿瘤微环境（TME）中多细胞亚型等亚群事件的能力**。
为了更深入地了解鼻咽癌的多细胞生态系统，研究人员应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术同时分析了鼻咽癌中恶性细胞、EB病毒、基质细胞和免疫细胞的转录组。他们还**系统地比较了肿瘤与非恶性组织的微环境**。通过这种方法可以更详细地分析肿瘤微环境中的细胞组成和相互作用，从而深入了解鼻咽癌的分子基础和潜在的治疗靶点。
三、结果
3-1：鼻咽癌多细胞生态系统的单细胞转录组特征分析
该研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）系统调查EBV病毒阳性鼻咽癌（NPC）的细胞多样性。以下是对研究方法和研究结果的总结和分析：
样本收集与制备
研究人员对来自三个EBV+鼻咽癌样本的1476个细胞进行了全长scRNA-seq测序，这些样本包括匹配的原发肿瘤和淋巴结转移瘤。
此外，他们还对来自17个EBV+鼻咽癌样本和7个非癌症鼻咽样本的102,525个细胞进行了基于3’液滴的scRNA-seq（10× Genomics）分析。
组织学检查
所有鼻咽癌活组织切片均进行了组织学检查，采用血红素和伊红（H&E）染色法和EBV病毒编码的小核糖核酸（EBERs）染色法，以确认EBV的存在并评估肿瘤特征。
质量检查
对检测到的唯一分子标识符（UMI）/基因编号和批次效应进行质量检查，以确保数据的可靠性。
细胞类型鉴定
根据典型基因标记的表达情况，采集了 9 种主要细胞类型的转录组。这些细胞包括 T 细胞、B 细胞、骨髓细胞、肥大细胞、成纤维细胞、内皮细胞、浆细胞树突状细胞等。结果与多重免疫组化（multiplex immunohistochemistry，multi-IHC）结果一致。
细胞聚类和差异表达
采用基于图形的聚类方法**将所有细胞分为 19 个聚类，每个聚类显示代表不同细胞类型或亚型的差异表达基因**（DEGs）。
拷贝数变异（CNV）分析
为区分恶性与非恶性细胞，从 scRNA-seq 数据中推断出大规模 CNV。恶性细胞是通过全基因组中广泛的 CNVs 确定的，这些 CNVs 与成对批量全基因组测序的 CNVs 一致。
EBV基因表达
EBV衍生测序读数主要位于EBV基因组的0-6 kb和150-170 kb区域，涵盖病毒潜伏基因（LMP1、LMP2A/2B、BARTs）和溶解基因（LF1、LF2、BALF3）。有趣的是，潜伏基因和溶解基因在单个宿主细胞内同时表达。
宿主-病毒相互作用
发现 EBV 基因 BNLF2a/2b 的表达与宿主免疫反应相关基因高度相关，这表明恶性细胞中可能存在宿主-病毒交叉对话。
结果与分析
该研究成功地以单细胞分辨率描述了鼻咽癌肿瘤的细胞组成及其微环境。肿瘤微环境中存在不同的细胞类型和亚型，这表明肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，可能有助于肿瘤的进展和对治疗的反应。
鉴定宿主细胞内表达的 EBV 基因以及 EBV 基因表达与宿主免疫反应基因之间的相关性，有助于深入了解宿主与病毒之间的相互作用，这种相互作用可能对鼻咽癌的发生和发展至关重要。这些信息对于了解 EBV 在鼻咽癌发病机制中的作用以及制定靶向治疗策略非常有价值。 CNV 分析有助于区分恶性细胞，这对于了解瘤内异质性和确定潜在治疗靶点非常重要。从scRNA-seq数据中推断出的CNV与从大量全基因组测序中推断出的CNV之间的一致性验证了该研究采用的方法。
总之，这项研究加深了我们对鼻咽癌细胞和分子异质性以及肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞和 EBV 病毒之间复杂相互作用的理解。研究结果可能会对鼻咽癌的诊断、预后和靶向疗法的开发产生影响。
3-2：鼻咽癌恶性细胞的上皮-免疫双重特征
该研究旨在调查鼻咽癌（NPC）恶性细胞的分子特征及其与患者预后的关系。以下是研究结果的摘要和分析：
非负矩阵因式分解（NMF）
研究人员将NMF应用于10个恶性细胞丰富的肿瘤，以识别共表达基因。结果从每个肿瘤中提取了5个程序，共计50个肿瘤内程序。
相关聚类分析
为识别鼻咽癌的共同特征，研究人员对这50个程序进行了相关聚类分析，从而在不同肿瘤中识别出两个突出的元程序。
免疫得分（IS）计算
根据从肿瘤内免疫程序中选出的 36 个基因的表达情况，计算出恶性细胞的免疫得分。该分数用于对细胞进行排序，并观察每个肿瘤内 IS 的梯度。
上皮细胞得分计算
为每个细胞计算上皮细胞得分，以检查其与单个细胞间 IS 的相关性。这有助于**区分恶性和非恶性细胞**。
对其他鼻咽癌样本进行多重 IHC、免疫荧光 (IF) 染色和流式细胞术，以验证上皮标记物和 HLA-DR 在单个恶性细胞中的共表达。
功能差异分析
根据HLA-DR的表达，将C17 PDX小鼠模型的肿瘤细胞分为IS-高（EpCAM+HLA-DRhi）和IS-低（EpCAM+HLA-DRlow）亚组。通过体外培养实验和体内肿瘤生长实验研究了它们的功能差异。
恶性细胞的双重特征
研究发现，鼻咽癌中的恶性细胞亚群表现出上皮-免疫双重特征。这些细胞同时表达上皮标记（如pan-CK或EpCAM）和免疫相关基因（如HLA-DPA1、ISG15、C3）。
与预后的关系
研究发现，恶性细胞中存在双重特征与鼻咽癌患者的不良预后密切相关。肿瘤细胞中 HLA-DR 的高表达与总生存率下降有关。
功能意义
免疫得分高（IS-高）的恶性细胞与免疫得分低（IS-低）的恶性细胞相比，具有更强的肿瘤发生能力。这一发现表明，双重特征有助于这些细胞的侵袭行为。
治疗意义
双重特征与不良预后之间的关联凸显了针对鼻咽癌中这一特定恶性细胞亚群开发靶向治疗策略的重要性。
总之，本研究为了解鼻咽癌恶性细胞的分子特征及其对患者预后的影响提供了新的视角。在这些细胞中发现上皮-免疫双重特征为鼻咽癌的靶向治疗和生物标记物的开发开辟了新的途径。
3-3：鼻咽癌中的 T 细胞集群和状态分析
该研究旨在**分析肿瘤和非恶性组织中T细胞的基因表达**，以了解它们在鼻咽癌（NPC）肿瘤微环境中的功能异质性和作用。以下是研究结果的摘要和分析：
T细胞基因表达分析
研究人员分析了33895个T细胞的基因表达，其中18931个细胞来自肿瘤，14964个细胞来自非恶性组织。
细胞聚类
将所有 T 细胞分为 13 个聚类，以代表 T 细胞群的功能异质性。
经典 T 细胞标记物表达
调查了 13 个聚类中经典 T 细胞标记物的表达和分布情况。
肿瘤与非恶性组织来源 T 细胞的比较
肿瘤来源 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与非恶性组织来源 T 细胞的基因表达结果比较。
CD8+T细胞的发育轨迹和评分计算
构建了CD8+T细胞的发育轨迹，并**根据典型标志物的表达计算了每个细胞的细胞毒性和衰竭评分**。
T细胞的功能异质性
鼻咽癌中的T细胞群表现出明显的功能异质性，不同的细胞群代表着不同的T细胞亚群，如调节性T细胞（Tregs）、滤泡T辅助细胞和细胞毒性T细胞。
肿瘤源性Tregs
代表Tregs的C4簇主要是肿瘤源性的，这表明鼻咽癌中存在一种可能有利于肿瘤生长的耐受性免疫微环境。
细胞毒性 T 细胞
代表细胞毒性 T 细胞的 C2、C7 和 C9 群组显示细胞毒性标记物的高表达和衰竭标记物的不同表达，表明存在激活耦合衰竭程序。这些细胞大多来自肿瘤，表明它们被肿瘤细胞和 EBV 感染激活和耗竭。
基因表达富集
肿瘤衍生的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞在 IFN 反应相关通路和糖酵解中表现出富集，反映出它们对肿瘤微环境的适应。
共刺激受体和共抑制受体
与非恶性肿瘤组织的 T 细胞相比，肿瘤来源的 T 细胞表现出共刺激受体和共抑制受体以及趋化因子受体的表达上调。
肿瘤源性 Tregs 的免疫抑制能力
肿瘤源性 Tregs 表现出较高的免疫抑制分子表达，这可能与 EBV 感染有关，表明它们在肿瘤微环境中起着介导免疫抑制的作用。
CD8+ T细胞的发育轨迹
CD8+ T细胞表现出细胞毒性活性从低到高的发育轨迹，同时伴随着衰竭的加剧。一部分 CD8+ T 细胞表现出较高的细胞毒性，但衰竭程度较低，这表明它们的功能状态可能存在差异。
耗竭标志物
在具有高细胞毒性和高耗竭的 CD8+ T 细胞中发现了已知的耗竭标志物和潜在的新型标志物，为了解鼻咽癌中 T 细胞耗竭的分子机制提供了见解。
总之，本研究详细分析了鼻咽癌肿瘤微环境中 T 细胞的功能异质性。研究结果突显了肿瘤细胞、EBV感染和免疫反应之间复杂的相互作用，并为鼻咽癌的治疗干预提供了潜在靶点。
3-4：鼻咽癌中骨髓细胞和基质细胞的集群和状态分析
这项研究**分析了肿瘤和非恶性组织中髓样细胞和成纤维细胞的转录组**，以了解它们在鼻咽癌（NPC）肿瘤微环境（TME）中的异质性和功能作用。以下是研究结果的摘要和分析：
髓系细胞转录组分析
分析了 6053 个髓系细胞的转录组，包括 4646 个肿瘤衍生细胞和 1407 个非恶性组织衍生细胞。根据基因表达模式，这些细胞被分为 12 个群组。
成纤维细胞转录组分析
分析了1416个成纤维细胞的转录组，包括1195个肿瘤来源的成纤维细胞和221个非恶性组织来源的成纤维细胞。利用基于图的聚类方法将这些成纤维细胞分为 7 个群组。
典型标志物表达和组织来源注释
根据典型标志物的表达及其组织来源对聚类进行注释。
发育轨迹分析
通过构建扩散图来描绘髓系细胞的发育轨迹，显示与 M1 和 M2 巨噬细胞表型相对应的潜在发育路径。
功能状态分析
通过比较肿瘤来源细胞和非恶性组织来源细胞的基因表达谱，分析髓系细胞和成纤维细胞的功能状态。
髓系细胞异质性
鼻咽癌中的髓系细胞表现出显著的异质性，代表了不同的细胞类型，如pDCs、朗格汉斯细胞、迁移性DCs、单核细胞/巨噬细胞和成纤维细胞。
巨噬细胞活化模式
单核细胞/巨噬细胞群中的M1和M2特征呈正相关，表明TME中的巨噬细胞活化可能遵循不同的模式，如M1-M2耦合活化。
炎症反应
肿瘤衍生巨噬细胞显示出炎症反应相关基因的上调，表明EBV慢性感染诱导了TME的高度炎症。
成纤维细胞异质性
鼻咽癌中的成纤维细胞分为肌成纤维细胞和癌相关成纤维细胞（CAFs），后者表达 IDO1 等免疫抑制因子。
胶原蛋白的产生
研究发现成纤维细胞集群中胶原蛋白的产生具有异质性，这表明**胶原蛋白的产生可能在TME中发挥不同的功能作用**。
IFN 反应
肿瘤来源的髓样细胞和成纤维细胞都显示出 IFN 反应相关基因的上调，进一步强调了**鼻咽癌 TME 中的慢性炎症状态**。
总之，本研究深入揭示了鼻咽癌TME中髓系细胞和成纤维细胞复杂的细胞异质性和功能状态。研究结果凸显了免疫细胞和基质细胞区的动态性和相互关联性，这可能会对肿瘤的微环境做出贡献并影响患者的预后。对特定细胞类型及其分子特征的鉴定可能会为鼻咽癌的诊断和治疗干预找到新的靶点。
3-5：鼻咽癌多细胞生态系统中的全局 IFN 反应
研究发现，鼻咽癌（NPC）肿瘤微环境（TME）中各种细胞类型的干扰素（IFN）反应明显上调。以下是研究结果的摘要和分析：
IFN反应分析
研究人员计算并比较了肿瘤来源细胞和非恶性组织来源细胞中每种主要细胞类型（T细胞、DC、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞）的IFN-α和IFN-γ得分。
全局 IFN 反应评估
IFN-α 和 IFN-γ 评分用于**评估 IFN 反应在鼻咽癌 TME 中的流行程度**。
IFN反应上调
研究发现，与非恶性组织相比，肿瘤来源的T细胞（CD4+和CD8+）、DC、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞中的IFN反应显著上调。
鼻咽癌TME中的全局IFN反应
IFN-α和IFN-γ评分表明，鼻咽癌TME中的IFN反应出现了全局上调。
病毒感染的作用
这种全局性的IFN反应特征在肺癌等其他癌症类型中未见报道，可能反映了病毒感染，特别是EB病毒感染，在塑造鼻咽癌TME中的作用。
分析
鼻咽癌中IFN反应的上调是一个耐人寻味的发现，因为这表明免疫系统正在对病毒或肿瘤细胞本身的存在做出积极反应。IFN 是一种细胞因子，在先天性免疫反应中起着关键作用，其上调可导致各种免疫相关效应，包括抗病毒和抗增殖活性。
这种 IFN 反应的全局性表明，它并**不局限于特定的细胞类型或细胞区，而是一种影响 TME 多个组成部分的系统性反应。这种广泛的 IFN 反应可能会影响鼻咽癌的预后和治疗，因为它可能会影响基于免疫的疗法的疗效**。
研究结果还凸显了鼻咽癌与其他癌症相比的独特之处，在其他癌症中，通常不会观察到类似的IFN反应。鼻咽癌的这一显著特征可能与EB病毒的慢性感染有关，EB病毒感染可导致肿瘤微环境中的慢性炎症和免疫激活。
总之，该研究为鼻咽癌中的全身 IFN 反应提供了证据，这可能是肿瘤免疫环境中的一个关键因素。了解这种 IFN 上调背后的机制，可以开发出针对鼻咽癌患者 IFN 反应的新免疫治疗策略。
3-6：鼻咽癌中的TME组成和细胞间相互作用
这项研究从单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中分析了细胞类型特异性标记物的表达模式，并在来自治疗无效患者的140个原发性鼻咽癌（NPC）肿瘤的批量RNA-seq数据中验证了这些模式。以下是研究结果的摘要和分析：
细胞类型特异性标记提取
从 scRNA-seq 数据中提取细胞类型特异性标记。
批量 RNA-seq 分析
对 140 例原发性鼻咽癌肿瘤的基因表达谱进行分析，并根据其 TME 组成将其分为 5 组（G1-G5）。
多重免疫组化染色
为验证TME分层，对其他鼻咽癌样本进行了多重免疫组化染色。
临床记录检查
检查患者的临床记录，以**评估TME组成分组与无进展生存期（PFS）之间的相关性**。
单细胞转录组与大容量RNA-seq整合
研究将单细胞转录组与大容量RNA-seq整合，以确定与细胞类型丰度相关的基因。
配体-受体相互作用分析
研究调查了单细胞中各种配体-受体对的表达情况，以评估 TME 中的细胞-细胞相互作用。
TME组成分组
根据免疫细胞和基质细胞的组成将肿瘤分为5组。G4组和G5组的免疫细胞特征较低，而G5组的成纤维细胞表达较高。G1、G2 和 G3 组的免疫细胞丰度较高，其中 G3 组的 B 细胞较多，G2 组的成纤维细胞比例较高。
组织微环境（TME）分层验证
组织微环境分层经多重IHC染色验证，发现与患者不同的PFS相关。
细胞与细胞之间的相互作用
发现成纤维细胞介导了组织微环境中肿瘤细胞和其他类型细胞之间的大部分**相互作用，这表明成纤维细胞在肿瘤进展中起着关键作用**。
免疫抑制相互作用
肿瘤细胞显示出与T细胞的免疫抑制相互作用，如PDL1-PD1和LGALS9-TIM3，这可能有助于**肿瘤免疫逃逸**，尽管有淋巴细胞浸润。
补体因子表达
成纤维细胞表达的补体基因与T细胞丰度高度相关，表明它们在T细胞招募和血管生成中的潜在作用。
肿瘤来源的内皮细胞（ECs）
肿瘤来源的ECs吸引T细胞和Tregs的能力增强，但也通过PDL2-PD1相互作用抑制T细胞和Tregs的活性。
巨噬细胞相互作用
源自肿瘤的巨噬细胞与 T 细胞和 Tregs 的趋化因子受体相互作用减少，但 CD86-CTLA4 相互作用增强。
分析
该研究对鼻咽癌的TME进行了全面分析，揭示了与临床结果相关的独特免疫细胞和基质细胞组成。细胞-细胞相互作用的鉴定及其对肿瘤进展和免疫逃逸的影响为了解鼻咽癌TME内复杂的相互作用提供了宝贵的见解。
如前所述，IFN反应的全面上调可能会导致鼻咽癌中观察到的慢性炎症和免疫激活。研究结果表明，成纤维细胞可能通过表达补体基因和其他配体，与TME中的各种细胞类型相互作用，在这种免疫反应中发挥了关键作用。
PDL1-PD1和LGALS9-TIM3等免疫抑制相互作用的发现，凸显了**肿瘤细胞即使在淋巴细胞大量浸润的情况下也有可能逃避免疫监视**。这一观察结果突出表明，需要能克服这些抑制机制的靶向免疫疗法。
总之，该研究提供了鼻咽癌 TME 的详细图谱，强调了各种细胞类型及其相互作用在肿瘤进展和免疫逃避中的作用。这些见解有助于为鼻咽癌患者制定更有效的诊断和治疗策略。
3-7：免疫调节和抑制双特征肿瘤细胞
该研究考察了鼻咽癌（NPC）中具有**上皮-免疫双重特征的肿瘤细胞的免疫相互作用和潜在免疫抑制**。以下是研究结果的摘要和分析：
相互作用分析
比较了**高IS和低IS**肿瘤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）之间的相互作用，以评估免疫招募、调节和抑制作用。
荧光激活细胞分拣技术（FACS）
检测了鼻咽癌组织中**TILs上共抑制受体的表达，发现其与IS-高肿瘤细胞的数量呈正相关**。
共培养实验
将TW03-EBV+细胞系的肿瘤细胞（IS-高/IS-低）与从鼻咽癌组织中分离的TILs共培养，以评估免疫抑制。
免疫招募和调节
IS高的肿瘤细胞表现出与T细胞更强的配体-受体相互作用，如CXCL11-CXCR3、C3-IFITM1和PDL1-PD1，这表明免疫招募和调节的潜力更大。
共抑制受体的表达
CD8+ TIL 上共抑制受体（PD-1、LAG-3、TIM-3、TIM-4、CD276）的表达与 IS-高肿瘤细胞的丰度呈正相关，表明这些 T 细胞存在更深层次的功能障碍。
共培养中的免疫抑制
与IS-高肿瘤细胞共培养的TIL产生的IFN-γ较少，表明**IS-高肿瘤细胞具有更强的免疫抑制能力**。
CD8+ T细胞的免疫功能失调
IS高的肿瘤细胞诱导了更高比例的CD8+ TILs具有共抑制受体表达，这表明这些肿瘤细胞可能会引发CD8+ T细胞更深层次的功能失调。
分析
研究显示，鼻咽癌中的IS-高肿瘤细胞对肿瘤微环境中的免疫反应有重大影响。这些细胞更善于招募和调节免疫细胞，可能是通过表达与T细胞受体结合的配体。CD8+ T 细胞上共表达的共抑制受体表明，IS-高的肿瘤细胞可能会导致这些细胞出现更严重的免疫功能障碍，进一步助长肿瘤免疫逃避。
与高IS肿瘤细胞共培养的TIL产生的IFN-γ减少表明，这些细胞能够抑制免疫反应，这可能不利于T细胞的抗肿瘤活性。这种免疫抑制可能是鼻咽癌上皮-免疫双重特征导致预后不良的关键因素。
这项研究强调了针对鼻咽癌中IS-高肿瘤细胞的重要性，因为它们的免疫调节功能可能是肿瘤进展的关键驱动因素，也是有效免疫治疗的障碍。开发克服这些细胞介导的免疫抑制的策略有可能改善鼻咽癌患者的预后。
四、讨论
该研究整合了单细胞转录组数据和大容量RNA-seq数据，全面剖析了EBV病毒阳性（EBV+）鼻咽癌（NPC）的多细胞生态系统。以下是研究结果的摘要和分析：
单细胞转录组和大容量RNA-seq整合
该研究整合了大规模单细胞转录组和大容量RNA-seq数据，以全面了解EBV+鼻咽癌中的细胞相互作用。
肿瘤细胞的上皮-免疫双重特征
鼻咽癌肿瘤细胞的上皮-免疫双重特征表现为 IFN 反应基因的表达，包括肿瘤细胞上 MHC II 基因的广泛表达。
肿瘤细胞上的MHC II 表达
MHC II 分子通常在专业抗原递呈细胞（如 DC、巨噬细胞）上表达，IFN-γ 可诱导上皮细胞表达。上皮细胞上表达的 MHC II 可与 CD8+ 和 CD4+ T 细胞相互作用。
MHC II 在癌症中的作用
MHC II 在癌症中的作用既复杂又矛盾。虽然它与某些癌症的有利结果有关，但也与其他癌症的免疫抑制有关。
肿瘤细胞和免疫受体
在鼻咽癌中，HLA-DR+肿瘤细胞在肿瘤浸润T细胞上表达共抑制免疫受体，表明其在免疫抑制中发挥作用。
共培养实验
为研究鼻咽癌肿瘤细胞与TIL之间的相互作用，我们进行了共培养实验。该实验表明，MHC II表达较强的肿瘤细胞可增强CD8+ T细胞的耗竭，促进肿瘤进展。
裸鼠肿瘤生长
采用裸鼠异种移植模型研究了高IS肿瘤细胞的肿瘤生长能力。结果表明，IS-高肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的增殖能力更强。
ISG15的表达与预后
采用免疫组化方法（IHC）评估了肿瘤细胞中IFN诱导基因ISG15的表达。ISG15的高表达与鼻咽癌患者更频繁的局部复发和更短的总生存期相关*。
IFN反应与预后
据推测，恶性转化后上皮细胞中持续的IFN反应有助于肿瘤细胞在受抑制的肿瘤微环境中存活，是鼻咽癌的一把 “双刃剑”。
鼻咽癌中的T细胞功能状态
研究对T细胞功能状态进行了scRNA-seq分析，为鼻咽癌患者正在进行的或未来的免疫疗法奠定了基础。
鼻咽癌中的巨噬细胞活化
鼻咽癌中的巨噬细胞活化遵循M1-M2耦合模式，表现出促炎症和促肿瘤特征。这可能与慢性EB病毒感染有关。
TME分层与预后
基于TME的分层可作为与治疗反应和患者预后密切相关的指标。
分析
该研究提供了EBV+鼻咽癌多细胞生态系统的详细分子特征，揭示了EBV、肿瘤和微环境之间复杂的相互作用。以 IFN 反应基因表达为特征的肿瘤细胞上皮-免疫双重特征，凸显了 IFN 通路在对抗病毒感染和促进肿瘤进展方面的重要性。
研究结果表明，肿瘤细胞上的 MHC II 表达可能具有双重作用，既能促进肿瘤特异性免疫反应，又能促进免疫抑制。这种复杂性凸显了进一步研究 MHC II 影响肿瘤微环境和患者预后机制的必要性。
ISG15表达与预后之间的相关性表明，IFN诱导基因可作为预测鼻咽癌预后的潜在生物标记物。这一发现对诊断工具和潜在治疗靶点的开发具有重要意义。
该研究对慢性 EBV 感染驱动的鼻咽癌巨噬细胞活化的 M1-M2 耦合模式的观察，有助于我们了解肿瘤微环境中的慢性炎症状态。
单细胞和大量 RNA-seq 数据的整合为剖析肿瘤微环境的复杂性及其对患者预后的影响提供了一种强有力的方法。
五、材料和方法
5-01：鼻咽癌样本和非恶性鼻咽组织
患者选择
研究对象包括确诊为**EBV病毒阳性（EBV+）鼻咽癌（NPC）的患者，或根据鼻咽内窥镜检查获得的鼻咽活检结果怀疑患有鼻咽癌**的患者。
活检部位
活检取自EBV+鼻咽癌患者的原发肿瘤或淋巴结转移灶。此外，活检取自正常人的非癌鼻咽组织。
样本数量
为进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），共有 **19 位 EBV+ 鼻咽癌患者提供了样本，包括原发肿瘤或淋巴结转移灶。此外，还从正常人身上采集了 7 份**非癌症鼻咽样本。
分析
使用治疗前活检可确保样本反映疾病的自然状态，这对了解鼻咽癌的分子基础至关重要。
同时纳入EBV+鼻咽癌患者和正常人为研究提供了有价值的比较。通过分析肿瘤组织和非癌症对照组，研究人员可以更好地了解鼻咽癌发生的分子变化。
scRNA-seq分析的样本量相对较小，这可能会限制研究的统计能力。不过，使用单细胞RNA测序是表征细胞异质性和了解肿瘤微环境中细胞类型复杂相互作用的有力工具。
总之，该研究的样本采集和伦理考虑有助于提高其科学严谨性，并为进一步研究鼻咽癌的分子机制奠定了基础。
5-02：肿瘤分离
肿瘤收集
新鲜肿瘤在切除时收集于 RPMI-1640 培养基中，这是一种常用的细胞培养基，可支持多种类型细胞的生长。
时间敏感性
活检组织在采集后 2.5 小时内处理，以确保细胞的活力。
酶解法
用机械方法将组织切成小方块（约 1-2 立方毫米），然后用含 LiberaseTM 和 DNase I 的 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）进行酶解。
解离条件
解离过程在 37°C 摇床中进行，以确保消化的一致性和有效性。
去除细胞碎片
酶解后，使用 70-μm 过滤器去除大块细胞和细胞碎片，以获得单细胞悬浮液。
去除红细胞和碎片
将过滤后的细胞轻轻加入 Lympholyte-H 的密度梯度中，以分离红细胞和碎片。这一步骤对于减少下游分析的背景噪声至关重要。
准备染色和流式细胞术
最后的单细胞悬浮液可进行染色和流式细胞术分析，从而根据特定标记物的表达来确定单个细胞的特征。
分析
所述方法是制备用于单细胞分析的肿瘤样本的标准程序。使用新鲜的肿瘤样本对保持生物材料的完整性非常重要，快速处理有助于保持细胞的活力。
使用 Liberase 和 DNase I 进行酶解是将组织解离成单细胞的常用方法，因为它能有效分解细胞外基质，而不会对细胞本身造成重大损伤。
清除大块细胞和细胞碎片对防止干扰流式细胞仪分析至关重要，因为流式细胞仪分析依赖于对单个细胞的精确测量。
使用 Lympholyte-H 密度梯度是将红细胞和碎片从细胞部分分离出来的标准技术，这对于避免在随后的流式细胞仪分析中对这些细胞进行错误分类至关重要。
总之，所述方法可确保样本为单细胞 RNA 测序和流式细胞术做好适当准备，从而详细描述肿瘤微环境的细胞组成。
5-03：单细胞分离、cDNA 扩增和文库构建
染色和流式细胞术
用 7-AAD （标记死细胞）、钙蓝 AM （标记活细胞）和 EpCAM （选择上皮细胞）抗体对单细胞悬浮液进行染色。然后在 MoFlo Astrios（Beckman Coulter）上使用流式细胞仪进行分析，以区分单细胞和双细胞，并筛选出有活力的细胞。
Smart-seq2 的分选
对于全长 Smart-seq2，将单细胞分选到含有细胞裂解缓冲液的 96 孔板中。将细胞分成 EpCAM+ 和 EpCAM- 两组，EpCAM+ 细胞分选到一个门，EpCAM- 细胞分选到另一个门。将平板密封并离心，使细胞沉淀，然后将其保存在 -80°C 温度下。
基于液滴的 scRNA-seq
对于基于液滴的 scRNA-seq，EpCAM+/EpCAM-细胞（比例为 1:10-1:1）在含有 1% FBS-PBS 的 PCR 管中富集。细胞悬浮液在冰上保存。在进入 10× Genomics GemCode 平台之前，使用 Neubauer 改良细胞计数板检测细胞数量和活力。
Smart-seq2程序修改
使用Superscript II反转录酶切换模板合成全长cDNA，并使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix进行扩增。
基于3’液滴的文库构建
在基于3’液滴的单细胞文库构建中，将细胞装入芯片以生成乳液凝胶珠（GEMs）。经过 GEM-RT 清理和 cDNA 扩增后，按照 10× Genomics 单细胞 3’ 试剂盒 V2 用户指南构建文库。
分析
所述方法是制备用于 scRNA-seq 的单细胞悬浮液的标准程序。使用流式细胞仪对有活力的单细胞进行分选对所获数据的质量至关重要，因为死细胞或双细胞会污染数据并导致错误的结论。
EpCAM+和EpCAM-细胞的分选对于研究肿瘤微环境的异质性非常重要，因为这些细胞群可能具有不同的分子特征和功能。
Smart-seq2 方案是一种成熟的单细胞全长转录组测序方法。对该方案的修改可确保其针对研究的具体要求进行优化。
基于液滴的 scRNA-seq 方法是一种高通量技术，可高效处理大量单细胞。GEM 的使用有助于将每个细胞封装在一个离散的液滴中，然后用于文库构建和测序。
总之，这项研究的方法展示了一种稳健且控制良好的流程，可从鼻咽癌样本中制备单细胞悬液，用于scRNA-seq，这对了解鼻咽癌复杂的分子结构至关重要。
5-04：批量 DNA 和 RNA 分离与测序
DNA提取
使用QIAamp DNA Mini试剂盒（QIAGEN）从鼻咽癌活检组织中分离DNA。
文库构建
使用Illumina平台的TruePre DNA Library Prep Kit V2（Vazyme）构建WGS文库。该试剂盒提供了简化的方案，可生成适合 WGS 的高质量文库。
文库定量和质量分析
使用高灵敏度dsDNA定量试剂盒（Invitrogen）进行文库定量，以确保文库制备到所需浓度。使用片段分析仪（Fragment Analyzer）的高灵敏度 NGS 片段分析试剂盒（AATI）进行质量分析，检查文库制备是否存在错误或污染物。
测序
所有样本均使用 Illumina HiSeq X Ten 平台进行测序。成对末端读数的长度为 150 bp。
RNA提取
使用商业RNA提取试剂盒（Omega）对另外18份NPC标本进行总RNA分离。这一步骤对于从标本中获取转录组信息至关重要。
文库构建
对于批量 RNA-seq，按照制造商的建议使用 Truseq RNA 文库制备试剂盒 v2（Illumina）构建文库。该试剂盒用于制备适合高通量测序的 RNA 文库。
测序
使用 Illumina HiSeq 2000 平台对样本进行测序，产生 100-bp 成对末端读数。
分析
所述方法可确保 DNA 和 RNA 样品的高质量，并适合进一步的测序分析。使用QIAGEN、Vazyme、Invitrogen和Illumina等知名公司的商业试剂盒和平台证明了所用技术的标准化和可靠性。
Illumina 平台生成的成对末端读数能很好地覆盖基因组和转录组区域，从而对样本进行全面分析。
质量分析步骤，如定量和片段分析，对于确保文库制备正确和测序数据质量良好非常重要。
总之，所述方法是对鼻咽癌样本进行基因组和转录组分析的一种稳健而行之有效的方法，为进一步确定该疾病的分子特征奠定了基础。
5-05：多重 IHC
样本选择
选择19名鼻咽癌患者的5个原发肿瘤的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）切片进行分析，这些患者之前曾接受过单细胞RNA测序（scRNA-seq）。
多重IHC
使用PANO多重IHC试剂盒（Panovue）检测特定细胞标记物，该试剂盒可在同一张玻片上同时检测多种抗原。标记物包括 CD3（T 细胞）、CD68（巨噬细胞）、CD19（B 细胞）、CD117（c-kit+ 细胞）、α-SMA（肌成纤维细胞）和 Pan-CK（上皮细胞）。
一抗染色和TSA（Tyramide Signal Amplification）
每种一抗应用后，玻片与二抗孵育，然后用TSA处理以增强信号。
抗原回收
玻片经过微波热处理抗原回收，使表位可被抗体结合。
细胞核染色
标记所有抗原后，用 DAPI 对细胞核染色，以提供对比度并观察细胞核。
多光谱成像
使用 Mantra 系统（珀金埃尔默公司）扫描染色玻片，该系统可在相同曝光时间内捕捉 20 纳米间隔（420-720 纳米）的荧光激发光谱。
图像分析
将扫描结果合并起来，生成一张**叠加图像**。从未染色和单一染色切片中建立组织和每种荧光素染料的自发荧光光谱库。InForm 图像分析软件（珀金埃尔默公司）使用此库来消除图像的混色并去除自发荧光。
分析
多重 IHC 和多光谱成像为评估 TME 的复杂性和异质性提供了有力的工具。通过同时检测多种细胞标记物，研究人员可以深入了解肿瘤微环境中不同类型细胞的相对丰度和空间排列。
免疫组化与多光谱成像相结合，可以消除不同荧光标记物信号的混杂，从而获得更清晰、更准确的图像，用于研究肿瘤微环境的细胞组成。
光谱库方法是多光谱成像的关键步骤，因为它有助于分离和识别不同的荧光信号，确保每个标记物都能准确量化和可视化。
总之，这种方法为评估鼻咽癌患者的TME提供了一种全面的方法，对于了解不同细胞类型之间复杂的相互作用及其在肿瘤进展和预后中的潜在作用至关重要。
5-06：免疫荧光（IF）染色和流式细胞术
样本制备
从 SYSUCC 获得 4-μm OTC 包埋的冷冻鼻咽癌样本。这些标本用 5% BSA 封闭，以防止抗体的非特异性结合。
抗体孵育
标本与抗-HLA-DRB1抗体（Abcam，Cat# EPR6148）和CK-pan（中山生物技术有限公司，Cat# ab16669）在4°C下孵育过夜，以便特异性结合。
反染色
培养后，标本用 DAPI（Sigma-Aldrich，Cat# D9524）反染色以观察细胞核。
成像
使用奥林巴斯 FV1000 共聚焦系统（奥林巴斯）对样本进行成像，该系统可提供高分辨率的三维样本图像。
组织解离
按照之前研究中所述的方法解离鼻咽癌组织，使用 Liberase 和 DNase I 进行酶解。
染色
用抗 EpCAM（Abcam，Cat# ab112068）和抗 HLA-DR（BD Pharmingen，Cat# 560651）对单细胞悬液进行染色，以确定特定的细胞群。
流式细胞仪分析
使用 MoFlo Astrios（Beckman Coulter）流式细胞仪测量染色细胞的相对丰度和特征。
数据分析
使用专为流式细胞仪数据分析而设计的软件包 FlowJo 10.2 版对流式细胞仪数据进行分析，以解释结果。
分析
通过 IF 染色程序可观察到鼻咽癌标本中的特定细胞标记，从而深入了解这些细胞在肿瘤微环境中的组成和潜在功能作用。共聚焦显微镜的使用确保了所获得图像的高分辨率，并能提供不同细胞类型之间空间关系的详细信息。
流式细胞术是一种功能强大的技术，可根据特定标记物的表达快速量化和表征细胞群。使用 MoFlo Astrios 和 FlowJo 软件可确保有效分析数据，从而识别鼻咽癌样本中不同的细胞群及其相对丰度。
总之，这些方法提供了有关鼻咽癌样本的互补信息，将 IF 染色的空间信息与流式细胞术的定量数据相结合，全面了解了肿瘤微环境的细胞组成和功能。
5-07：IHC 和免疫反应评分
患者选择和随访
FFPE鼻咽癌标本是从接受放疗或化疗前临床诊断为鼻咽癌的患者身上采集的。患者确诊时间为2008年至2010年，幸存者的随访时间为9至112个月（中位数为74.17个月）。
免疫组化（IHC）分析
采用稀释为1:600的HLA-DR抗体（Abcam，Cat# ab92511）对4μm的FFPE切片进行IHC分析。切片在柠檬酸抗原检索液（pH 6.0）中微波煮沸 2.5 分钟，以暴露表位供抗体结合。
一抗孵育后，切片在 37°C 下用二抗染色 30 分钟。然后用 3,3’-二氨基联苯胺（DAB）染色 2 分钟，再用 Mayer’s 苏木精反染以显示细胞核。
脱水和装片
对切片进行脱水和装片，以便进一步分析。
免疫反应评分
肿瘤细胞的免疫反应由两名独立的病理学家评分，他们对患者的临床特征保密。颜色反应的强度从0（无染色）到3（强染色），染色肿瘤细胞的百分比从0%到100%。
IHC 评分计算
两位病理学家评分的平均值作为最终的 IHC 评分。然后计算 IHC 得分，即强度得分与百分比得分的乘积。
患者分组
根据肿瘤细胞中 HLA-DR 免疫染色的中位分数，将所有鼻咽癌患者分为**高表达亚组和低表达亚组**。
分析
所述方法是对FFPE标本进行IHC分析的标准方法。使用微波进行抗原回收很常见，能有效增强抗体与目标表位的结合。所使用的评分系统是量化免疫染色强度和范围的成熟方法，可提供有关鼻咽癌肿瘤细胞中 HLA-DR 表达的宝贵信息。
由两名独立病理学家进行盲法评分可确保结果的可靠性和客观性。中位分数可作为将患者分为高表达亚组和低表达亚组的分界线，有助于进一步分析 HLA-DR 表达在鼻咽癌中的临床意义。
总之，对鼻咽癌标本中 HLA-DR 表达的 IHC 分析为了解该标记物在疾病中的作用提供了宝贵的工具，并可能对预后和治疗反应产生影响。
5-08：CCK-8 试验和肿瘤生长试验
CCK-8测定
为测定细胞活力，对EpCAM+HLA-DRhi和EpCAM+HLA-DRlow C17肿瘤细胞进行了CCK-8测定（Beyotime，Cat# C0038）。
细胞接种
将细胞以每孔 1 × 104 个的密度接种在经胶原处理的 96 孔板上，让其生长 6 天。
加入 CCK-8 和孵育
第 6 天，在每个孔中加入 20 µL CCK-8，然后将平板孵育 4 小时。
光密度（OD）测量
使用波长为 450 nm 的微孔板阅读器测量所有样品的光密度（OD）值。
动物模型
雌性 BALB/c 裸鼠（4-6 周，n = 12）购自 GemPharmatech 公司，按照中国关爱委员会研究所批准的方案在微隔离笼中饲养。
细胞悬液注射
12只小鼠被随机分为两组，分别皮下注射100 µL细胞悬液混合物，其中包含悬浮在matrigel和胶原蛋白I中的EpCAM+HLA-DRhi或EpCAM+HLA-DRlow C17肿瘤细胞。
肿瘤大小测量
当可以触摸到肿瘤时，每天用卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积的计算公式为 0.5 × 长度 × 宽度²。
肿瘤称重和组织处理
所有小鼠在注射后第 36 天处死。称量单个肿瘤的重量并将其包埋在 10%石蜡中，以便进一步分析。
HLA-DR表达评估
按照研究之前的描述，通过免疫组织化学（IHC）评估每个组织样本中的HLA-DR表达。
分析
CCK-8检测法是一种常用且可靠的细胞存活率测量方法，它通过量化存活细胞对CCK-8试剂的还原作用来测量细胞存活率。使用六联孔和波长为 450 nm 的微孔板阅读器可确保测量的准确性和一致性。
向裸鼠皮下注射肿瘤细胞悬浮液是研究肿瘤生长和转移的标准模型。使用裸鼠可以消除免疫功能健全的小鼠可能出现的免疫反应，从而在相对受控的环境中研究肿瘤细胞的生长。
每天的肿瘤大小测量和体积计算可对肿瘤随时间的生长情况进行定量测量。肿瘤重量和石蜡包埋可用于组织学分析，包括**通过 IHC 评估 HLA-DR 的表达，这对了解该标记物在肿瘤生长和转移中的作用非常重要**。
总之，该研究的方法将体外细胞活力测量与裸鼠模型体内肿瘤生长研究相结合，对鼻咽癌细胞亚群的致瘤潜力进行了全面评估。使用 EpCAM 和 HLA-DR 作为标记有助于区分具有潜在不同生物学行为的细胞群。
5-09：鼻咽癌组织 TIL 上协同抑制受体的表达
样本制备
采用研究前文所述的相同方法，将其他鼻咽癌组织（n = 27）离解成单细胞悬浮液。
分割悬浮液
每个单细胞悬浮液被平均分成两半。一半用于检测 TIL 上共抑制受体的表达，另一半用于检测 EpCAM+HLA-DRhi 细胞的丰度。
用CD3（BioLegend）、PD-1（BioLegend）、Tim-3（BioLegend）、PE抗人LAG-3（BioLegend）、Tim-4（BioLegend）、CD8（BD Pharmingen）、CD276（BD Pharmingen）和CD4（BD Pharmingen）抗体对单细胞悬液进行染色。
用抗 EpCAM（Abcam）和抗 HLA-DR （BD Pharmingen）对悬浮液进行染色。
流式细胞仪检测
所有检测均在 CytoFLEX S（Beckman Coulter）流式细胞仪上进行。
数据分析
使用 FlowJo 和 GraphPad Prism 8.3.0 软件分析流式细胞仪数据。这些软件包通常用于流式细胞仪数据的可视化和统计分析。
分析
流式细胞术分析可快速准确地量化鼻咽癌组织中的特定细胞群及其标记物表达。使用多种抗体同时检测各种标记物，可全面了解肿瘤微环境中的免疫反应。
TIL上共抑制受体的表达与EpCAM+HLA-DRhi细胞的丰度之间的相关性让人了解到这些细胞类型之间潜在的相互作用及其对肿瘤进展和免疫逃避的影响。
使用 FlowJo 和 GraphPad Prism 进行数据分析可确保正确解释结果，并对研究结果的统计学意义进行适当评估。
总之，所述方法是癌症研究中流式细胞术分析的标准方法，使用 EpCAM 和 HLA-DR 作为标记物有助于识别不同的细胞群，这些细胞群在功能和预后意义上可能存在差异。
5-10：肿瘤细胞制备和体外 T 细胞扩增共培养实验
胰蛋白酶化
将 TW03-（EBV+）肿瘤细胞胰蛋白酶化，使其脱离培养板，悬浮于 RPMI-1640 培养基中。
FACS 染色
用 HLA-DR 和 EpCAM 抗体对单细胞悬浮液进行染色，使用 MoFlo Astrios 进行流式细胞术（FACS）分析。
细胞亚群的富集
EpCAM+HLA-DRhi 和 EpCAM+HLA-DRlow 细胞亚群通过 FACS 富集，如前所述。
组织收集
收集更多的鼻咽癌肿瘤组织，并使用之前描述的酶解方法将其处理为单细胞悬浮液。
细胞悬浮液密度
单细胞悬浮于 X-VIVO 15 培养基（Lonza）中，密度为 2 × 10^6 cells/mL。
TIL扩增
由于从新鲜的鼻咽癌活检组织中获得的T细胞数量有限，TIL的扩增是通过在X-VIVO 15培养基中添加青霉素、链霉素和重组人白细胞介素-2（rhIL-2）（Stemcell Technologies）进行的。
流式细胞术检测
使用流式细胞术根据人类主要组织相容性复合体（MHC）I类分子HLA-A2的表达检测TIL。
HLA-A2+ TIL的筛选
只有HLA-A2+ NPC TIL（n = 3）与TW03-EBV+的MHC I亚型相匹配，并进一步扩增7-14天，然后与EpCAM+HLA-DRhi和EpCAM+HLA-DRlow TW03-（EBV+）肿瘤细胞共培养。
分析
使用胰蛋白酶从培养板上分离肿瘤细胞是制备悬浮培养或进一步处理细胞的标准方法。使用 HLA-DR 和 EpCAM 抗体染色可根据细胞表面标记物的表达情况识别和分离特定的细胞亚群。
由于从新鲜鼻咽癌活检组织中获得的 T 细胞数量有限，因此有必要扩增 TIL，以确保有足够的细胞用于共培养实验。使用 X-VIVO 15 培养基并定期添加新鲜培养基和 rhIL-2 可促进 TILs 的生长和维持。
选择与 MHC I 亚型相匹配的 HLA-A2+ TIL 可确保共培养实验使用的 TIL 可能与 TW03-(EBV+) 肿瘤细胞具有兼容的抗原递呈能力。
总之，所述方法可确保为共培养实验正确制备肿瘤细胞和 TIL，这对研究这些细胞类型之间的相互作用及其对肿瘤进展和免疫反应的潜在影响至关重要。
5-11：共培养和 ELISPOT 检测 TIL 产生的 IFN-γ
TILs悬浮液
TILs 以 0.5 × 10^6 cells/mL 的密度悬浮于 X-VIVO 15 培养基中。
肿瘤细胞比例
TIL 与 EpCAM+HLA-DRhi 和 EpCAM+HLA-DRlow 肿瘤细胞以不同比例（100:1、50:1 或 20:1）共培养 6 小时。
ELISPOT 设置
使用预先涂布的 BD™ 人 IFN-γ ELISPOT 套装（BD Pharmingen）进行共培养，每孔 100 μL，37°C，5% CO2 环境。
清洗和检测抗体
共培养后，清洗平板以去除未结合的细胞和碎片。然后用生物素化的检测抗体进行孵育。
Streptavidin-HRP Conjugate
将平板与 Streptavidin-HRP （Sangon Biotech）进一步孵育，以放大信号。
AEC 底物显色
孔中加入 AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）底物（Solarbio）显色，显示 IFN-γ 产细胞。
停止反应和干燥
用去离子水冲洗孔，停止显影反应，然后在室温下风干平板。
IFN-γ产生细胞计数
根据制造商的说明，使用 ImmunoSpot S6 分析仪（细胞技术有限公司）计数 IFN-γ 产生细胞的数量。
分析
使用 ELISPOT 进行的共培养实验可检测特定细胞群产生 IFN-γ 的细胞。ELISPOT 分析是一种灵敏而特异的方法，能以高通量的形式测量单个细胞产生的细胞因子。
使用不同的 TILs:Tumor 细胞比例可提供一系列条件来评估肿瘤细胞亚群对 IFN-γ 生成的影响。选择 6 小时的共培养时间是为了让细胞类型之间有充分的相互作用。
预涂 ELISPOT 板和使用生物素化检测抗体以及 Streptavidin-HRP 结合物可确保检测的稳健性和灵敏度。AEC 底物是一种比色底物，与 HRP 反应后会产生红色，便于观察和计数代表 IFN-γ 生成细胞的斑点。
ImmunoSpot S6 分析仪用于自动计数和分析斑点，提供每种条件下产生 IFN-γ 的细胞数量的定量数据。
总之，所述方法是在共培养环境中研究肿瘤细胞免疫反应的一种行之有效的方法。使用 IFN-γ 作为读数突出了 TIL 在肿瘤微环境中的免疫监视和潜在抗肿瘤活性的作用。
5-12：共培养和 TIL 上共抑制受体的表达
TILs悬浮液
TILs 以 5 × 10^5 cells/well 的密度悬浮于 VIVO-15 培养基中。
肿瘤细胞悬浮液
IS 高和 IS 低的肿瘤细胞以 5 × 10^3 个/孔的密度悬浮于 VIVO-15 培养基中。
共培养条件
TILs 和肿瘤细胞在低剂量 rhIL-2（240 IU/mL）存在下于 48 孔板中共培养 48 小时，培养温度为 37°C，培养环境为 5% CO2。
抗体染色
共培养后，用一组针对 CD3、CD4、EpCAM、HLA-DR、CD8、PD-1、Tim-3、LAG-3、Tim-4 和 CD276 的抗体对细胞进行染色，以检测 TIL 上共抑制受体的表达。
流式细胞仪分析
染色细胞用 CytoFLEX S 流式细胞仪进行分析，该仪器以高灵敏度和多参数功能著称。
数据分析
使用 FlowJo V10.2 软件分析流式细胞仪数据，该软件常用于流式细胞仪数据的可视化和统计分析。
分析
共培养实验可以研究 TIL 与肿瘤细胞之间的相互作用，这对了解肿瘤微环境中的免疫反应至关重要。使用低剂量 rhIL-2 有助于在共培养期间维持 TIL 的活力和功能。
所使用的抗体组能全面观察各种协同抑制受体的表达，这对了解免疫调节机制的作用非常重要。CytoFLEX S 流式细胞仪非常适合这类分析，它具有高分辨率和多参数功能，可以检测和量化这些受体的表达。
使用 FlowJo V10.2 软件进行数据分析可确保正确解释结果，并对结果的统计意义进行适当评估。
总之，所述方法是癌症研究中流式细胞术分析的标准方法，使用共抑制受体作为标记物有助于识别在功能和预后意义上可能存在差异的不同细胞群。
5-13：处理 RNA-seq 数据（Smart-seq2）
构建混合参考基因组
构建混合参考基因组，其中包含人类（加州大学洛杉矶分校 hg19）和 EBV（NCBI NC_007605.1）参考序列。这样就能将单细胞 RNA 测序的读数与人类基因组和病毒基因组进行精确比对。
配对端读数比对
使用 Bowtie 2（默认参数）将每个单细胞的配对端读数与人类-EBV 混合基因组进行比对。
宿主基因表达量化
与人类参考基因组对齐的读数用于量化宿主基因的表达水平。
百万转录本（TPM）计算
最初使用 RSEM（1.3.0 版）计算每个基因的 TPM 值，然后将其转换为 log2 标度，使数据正常化。
保存基因得分（HKGS）计算
根据先前定义的基因列表计算每个细胞的 HKGS。HKGS 低于 3.5 的细胞将被过滤掉。
总表达量计算
对于剩余的细胞，每个基因的总表达量（Ea）按该基因在所有细胞中的平均 TPM 的对数 2 计算。
基因表达筛选
Ea 小于 4 的基因不做进一步分析。
相对表达计算
每个基因的相对表达值（Er）计算为当前细胞中该基因的 log2 表达值减去所有细胞中该基因的平均 log2 表达值。
EBV 基因表达定量
利用 Cufflinks 对映射到 EBV 基因组的读数进行病毒基因表达水平的定量。
EBV 基因转录本定义
为减少 EBV 基因开放阅读框重叠对基因表达定量的影响，本研究**使用基因编码序列（CDS）区域来定义 EBV 基因的转录本**。
分析
所述方法是一种行之有效的 scRNA-seq 数据分析方法，尤其适用于涉及宿主和病毒转录组的研究。混合参考基因组的使用确保了人类基因和病毒基因的准确比对和量化。
TPM 计算和随后的 log2 转换是 scRNA-seq 数据归一化和表达量化的标准步骤。HKGS 计算有助于筛选出可能尚未完全分化或存活率较低的细胞。
总表达量计算提供了一种基因在所有细胞中的总体表达量，而相对表达量计算则提供了一种基因在当前细胞中的表达量与所有细胞平均表达量的比较。
使用 CDS 区域定义 EBV 基因转录本是确保病毒基因表达量准确量化的常用方法。
总之，所述方法非常稳健，适合分析鼻咽癌样本的 scRNA-seq 数据，可在单细胞水平上同时分析宿主和病毒基因的表达。这种方法能为了解宿主与病毒之间的相互作用及其在肿瘤进展中的潜在作用提供有价值的见解。
5-14：处理 RNA-seq 数据（10× 基因组学）
数据解复用
使用 CellRanger 的 "CellRanger mkfastq "命令将 10× Genomics 平台上的原始碱基调用（BCL）文件解复用为 FASTQ 文件。
配准和定量
解复用的 FASTQ 文件由 "CellRanger 计数 "处理，以进行配准并定量单细胞的基因表达水平。这是通过条形码识别和唯一分子标识符（UMI）计数实现的。
基因表达筛选
在每个肿瘤中，去除所有细胞中没有表达的基因。UMI 计数大于 1 的基因被视为表达基因，表达基因少于 700 个的细胞被过滤掉。
百万转录本（TPM）类似值计算
对于剩余的细胞，用 UMI 计数除以该细胞中 UMI 计数的总和，再乘以 10,000 即可计算出每个基因的 TPM 类似值。然后将该值转换为 log2 比例（log2(TPM + 1)）。
相对表达计算
每个基因（Eri,j）的相对表达水平计算为当前细胞中该基因的 log2 表达值（Ei,j）减去所有细胞中该基因的平均 log2 表达值（average(Ei,1…n)）。
非恶性细胞分析
使用 "CellRanger aggr "管道合并来自不同肿瘤的细胞。通过均衡不同文库的读取深度，对合并后的数据进行归一化处理。
数据转换和进一步分析
使用 R Seurat 软件包（2.1.0 版）将输出数据转换为 Seurat 对象，以进行进一步分析。
分析
所述方法是处理 10× Genomics 平台上生成的 scRNA-seq 数据的标准工作流程。CellRanger 因其高效、易用而备受青睐，尤其是在处理大型数据集时。 使用 UMI 计数有助于减少 PCR 扩增偏差，并能更准确地量化基因表达。
TPM 样值计算提供了基因表达的标准化测量，这对于比较不同细胞和文库的基因表达至关重要。 相对表达计算可比较单个细胞内不同时间或不同条件下的基因表达水平。 合并来自不同肿瘤的细胞，然后进行归一化处理，可确保不同样本间的数据具有可比性，这对研究 TME 和识别非肿瘤特异性细胞类型至关重要。 将数据转换为 Seurat 对象并使用 R Seurat 软件包进行后续分析后，就可以**应用主成分分析 (PCA) 等降维技术和聚类算法来识别数据集中的细胞类型和亚群**。
总之，所述方法非常适合分析来自鼻咽癌样本的 scRNA-seq 数据，为表征肿瘤微环境中的细胞异质性提供了一种全面的方法。
5-15：基于 scRNA-seq 数据推断 CNV
Gene Expression Data Preparation
根据基因组位置对基因进行排序，并对每个基因的相对表达值采用 100 个基因的滑动平均策略，以生成初始 CNV。
Initial CNV Calculation
细胞 n 在基因 i 上的初始 CNV（iniCNV）用以下公式计算： CNVn(i)=\sum_{j=i-50}^{i+50}Ern(oj)/101 ，其中，CNVn(i) 是细胞 n 中基因 i 的初始 CNV，Ern(oj) 是细胞 n 中基因 j 的相对表达值，总和是以基因 i 为中心的 101 个基因窗口的总和。
Smart-seq2 Data Adjustment
对于 Smart-seq2 数据，相对表达值 (Ei,j) 的定义如下： Ei,j = \log_2(TPMi,j/10 + 1) ，以便在 CNV 分析中实现更好的可视化。为考虑异常值的影响，相对表达值大于 3 时调整为 3，小于-3 时调整为-3。
Sliding Window Adjustment
除表达基因数少于 100 个的 13、18 和 21 号染色体外，滑动窗口均在每个染色体内计算。在这些情况下，滑动窗口被扩展到覆盖其相邻染色体上的初始和最终 50 个基因。
Normalization of Initial CNVs
为了进一步归一化初始 CNVs，至少选择两种不同类型的非恶性细胞作为对照，从而定义多个基线。最终归一化的 CNVs（Smart-seq2）定义为： nomCNV=\left\{ \begin{array}{l} iniCNV-Max\_base, \text{~if } iniCNV>Max\_base+0.2\\ iniCNV-Min\_base, \text{~if } iniCNV<Min\_base-0.2\\ 0, \text{~if } Min\_base-0.2<iniCNV<Max\_base+0.2 \end{array} \right.
其中，nomCNV 是最终归一化 CNV，iniCNV 是初始 CNV，Max_base 和 Min_base 分别是最大基线和最小基线。
10× Genomics Data Normalization
最终归一化的 CNV（10× Genomics）定义为： nomCNV=\left\{ \begin{array}{ll} iniCNV-\max base, \text{~if } iniCNV>Max\_base+0.1\\ iniCNV-Min\_base, \text{~if } iniCNV<Min\_base-0.1\\ 0, \text{~if } Min\_base-0.1<iniCNV<Max\_base+0.1 \end{array} \right.
分析
所述方法是一种从 scRNA-seq 数据中推断 CNV 的复杂方法。使用滑动平均策略有助于平滑表达值并减少噪音，从而**检测出反映每个细胞基因组状态的 CNV**。
将相对表达值调整为对数2，并设置极值阈值，有助于对数据进行归一化处理，防止异常值对 CNV 推断产生影响。
对于表达基因较少的染色体，扩展滑动窗口以覆盖相邻染色体，可确保 CNV 分析不会因缺乏数据而产生偏差。
通过选择不同类型的非恶性细胞作为对照，使用多基线为数据归一化提供了一种稳健的方法，并能根据基因组特征区分恶性和非恶性细胞。
5-16：基于低通滤波器的全基因组测序推断 CNV
**低通测序**是一种基因组测序深度低于全基因组测序深度的技术，在检测大规模变化（如拷贝数变异）方面更具成本效益。下面是对这一过程的逐步总结和分析：
数据生成
通过对鼻咽癌样本进行低通滤波器全基因组测序，生成成对端读数。成对端测序可提供原始 DNA 片段上两个读数之间的距离信息，这对提高读数映射的准确性和识别大的结构变异非常有用。
读数映射
成对末端读数被映射到人类参考基因组（hg19），这是一个广泛使用的人类基因组参考序列版本。这项工作使用 Burrows-Wheeler Aligner (BWA)完成，这是一种将测序读数与参考基因组进行比对的快速而准确的工具。
PCR 重复去除
制图完成后，去除 PCR 重复序列。在文库制备的 PCR 扩增步骤中可能会出现这些重复序列，如果不去除这些重复序列，拷贝数的估算就会出现偏差。
覆盖深度计算
覆盖深度（与基因组中每个碱基对齐的读数数量）是通过 Samtools 计算得出的，Samtools 是一套用于处理 SAM 格式对齐的工具。深度 "命令专门报告基因组中每个位置或区域的深度。
基因组分割
将基因组分割成小窗口（0.5 Mb 大小），并计算每个窗口的总覆盖深度。通过这一步骤可以更细致地了解整个基因组的拷贝数变化。
归一化
每个窗口的总深度按测序数据量进行归一化处理，以考虑不同样本测序深度的差异。这一步骤对于公平比较不同样本至关重要。
GC 含量偏差校正
应用黄土归一化来校正与基因组 GC 含量相关的偏差。GC 含量会影响 DNA 测序的效率，这种归一化可确保观察到的深度差异不完全是由于 GC 含量的变化造成的。
深度比计算
以白细胞样本的总深度为对照，计算每个肿瘤样本全基因组的深度比。这有助于确定肿瘤样本与正常样本相比基因组中被扩增或删除的区域。
**使用循环二进制分割（CBS）**进行分割
CBS 算法在 R DNACopy 软件包中实现，用于将具有相似深度比的窗口合并为基因组片段。该算法旨在检测拷贝数变化一致的区域，将基因组划分为拷贝数不变的片段。
片段合并
使用 MergeLevels 进一步合并 CBS 确定的相邻片段，该功能可能会合并代表较小拷贝数变化的邻近片段，从而减少噪音并提高拷贝数调用的精确度。
总之，该工作流程是分析低通滤波全基因组测序数据以检测鼻咽癌中 CNV 的综合方法。通过对数据进行仔细处理和归一化，并使用复杂的算法进行分割，研究人员可以确定可能与疾病相关的大规模基因改变。这种分析的结果有可能使人们更好地了解导致鼻咽癌发展、预后和治疗反应的遗传因素，从而对个性化医疗产生重要影响。
5-17：非恶性细胞集群
数据聚合
使用 "CellRanger aggr "管道合并不同肿瘤的 scRNA-seq 数据。这一步合并了多个样本的基因表达矩阵，对于分析由多个文库或样本组成的数据集至关重要。
归一化
对不同文库的读取深度进行均衡化处理，以考虑不同样本之间可能存在的测序深度差异。这一步骤可确保基因表达水平的差异不完全是由于测序深度的技术差异造成的。
数据转换
Seurat对象是R语言中专门用于单细胞分析的数据结构，用于存储表达矩阵、细胞元数据和各种分析结果。
质量控制
剔除检测到的基因少于 500 个和在少于 10 个细胞中表达的基因的细胞。这一步骤有助于剔除低质量的细胞和基因，因为它们可能无法提供有用的生物学信息。
对数归一化
使用 Seurat 中的 "NormalizeData "功能对表达矩阵进行对数归一化处理。对数归一化是 scRNA-seq 分析中的一种常用技术，可将数据转换为更高斯分布，适合许多下游分析。
变异基因鉴定
根据平均表达量和离散度确定可变表达基因。这些基因很可能包含有用的生物信号，并用于进一步分析。
回归
使用 "SeData "功能将表达矩阵与 UMI 总计数、细胞周期评分、线粒体读数计数和文库 ID 进行回归。这一步骤有助于去除技术噪音和生物混杂因素，如细胞周期阶段和线粒体含量。
降维
使用变量基因进行主成分分析（PCA），以降低数据的维度。PCA 将数据转换成一组新的坐标，以捕捉数据中最大的变异来源。
统计意义
使用 "JackStraw "函数确定 PCA 分数的统计意义。这有助于确定哪些主成分是由随机噪声驱动的，哪些是有生物意义的。
t-SNE 可视化
前 10 个主成分用于 t 分布随机邻域嵌入（t-SNE），这是一种非线性降维技术，可将数据投射到二维地图上进行可视化。
细胞聚类
使用 "FindClusters "函数以 0.5 的分辨率识别细胞簇。分辨率参数会影响检测到的细胞簇的数量和大小，分辨率越高，细胞簇越多。
细胞类型注释
根据典型标记物的表达，将 t-SNE 图中的细胞注释为不同的细胞类型。这一步骤包括根据特定标记基因的表达，将每个细胞的基因表达谱与已知的细胞类型相匹配。
双重和模糊排除
一组同时表达 T 细胞和 B 细胞标记基因的细胞被排除在进一步分析之外，这些细胞位于 t-SNE 投影中的 T 细胞群和 B 细胞群之间。这些细胞很可能是双细胞（在同一液滴中捕获两个细胞）或被环境 RNA 污染，从而导致对数据的错误解读。
总之，该工作流程是分析鼻咽癌肿瘤单细胞 RNA 测序数据的综合方法。通过对数据进行仔细的预处理和归一化，并使用复杂的降维、聚类和注释方法，研究人员可以识别和描述肿瘤微环境中的不同细胞类型。这样的分析结果有可能让人们更好地了解鼻咽癌的细胞组成及其对肿瘤进展、转移和治疗反应的影响。
5-18：解密鼻咽癌的瘤内表达程序和元程序
非负矩阵因式分解是一种计算方法，用于将基因表达数据矩阵分解为两个或两个以上的矩阵，这些矩阵相乘后近似于原始矩阵。这种方法对于识别复杂数据集中的基因表达模式或程序特别有用。下面是对这一过程的逐步总结和分析：
数据选择
分析的重点是恶性细胞数量最多的 10 个肿瘤。选择这个子集是为了确保基因表达数据最能代表肿瘤的生物学特性。
预处理
针对每个肿瘤，为 NMF 准备相对表达矩阵，其中包括来自 Smart-seq2 和 10x Genomics 平台的数据。表达矩阵中的负值用零代替，因为 NMF 需要非负的输入数据。
基因筛选
为了集中处理每个肿瘤内表现出变异性的基因，对 Smart-seq2 和 10x Genomics 数据采用了不同的表达标准偏差阈值。对于 Smart-seq2，表达标准偏差小于 0.8 的基因被排除在外，而对于 10x Genomics，表达标准偏差小于 0.5 的基因被过滤掉。
NMF应用
将 NMF 应用于预处理后的表达矩阵，以识别每个肿瘤内的潜在表达程序。该算法成功地从每个肿瘤中提取出五个潜在程序，从而在 10 个肿瘤中总共提取出 50 个肿瘤内表达程序。
细胞分数计算
为了研究 50 个特征的共性，计算了 10 个肿瘤中每个程序的**细胞得分（CS）**。细胞得分代表肿瘤中每个细胞表现出特定程序表达模式的程度。
相关分析和聚类
根据细胞得分计算程序的皮尔逊相关系数，并根据其相似性将程序聚类为元程序。这一步是将在不同肿瘤中具有相似表达模式的程序集中在一起。
元程序分析
确定了 "细胞周期 "和 "免疫反应 "这两个普遍存在的元程序，以便进行进一步分析。这些元程序可能代表了在多个肿瘤中都很活跃的具有生物学意义的通路，可能有助于肿瘤的进展或对治疗的反应。
总之，本工作流程使用 NMF 将鼻咽癌肿瘤的复杂基因表达数据分解为一系列不同的肿瘤内表达程序。通过识别和描述这些程序，研究人员可以深入了解肿瘤内活跃的生物过程，并有可能发现新的治疗靶点或生物标记物。对细胞周期和免疫反应元程序的关注表明，这些途径在鼻咽癌中尤为重要，值得进一步研究。
5-19：细胞周期分析
细胞周期是一个高度调控的过程，它控制着细胞的生长和分裂，而细胞周期失调是癌症的特征之一。下面是对这一过程的总结和分析：
基因列表选择
研究人员使用了之前定义的基因列表，其中包含 43 个与细胞周期 G1/S 期转变相关的基因和 54 个与细胞周期 G2/M 期转变相关的基因。已知这些基因的表达与细胞周期有关，可用于推断单个细胞的细胞周期阶段。
表达谱分析
在每个肿瘤的单个细胞中分析这些细胞周期相关基因的表达模式。这一步骤包括测量每个细胞中 G1/S 和 G2/M 基因的表达水平，以确定其细胞周期状态。
计算 G1/S 和 G2/M 评分
计算每个细胞的 G1/S 和 G2/M 基因的平均表达值（分别为 G1/S 评分和 G2/M 评分）。这些分数代表了每个细胞中细胞周期各阶段的相对活性。
统计分析
进行基于 t 检验的统计分析，将单个细胞的得分与所有细胞的平均得分进行比较。这一步骤有助于找出细胞周期基因表达量明显较高的细胞，表明细胞周期进展活跃。
细胞周期阶段分配
根据细胞的 G1/S 和 G2/M 评分和统计学意义，将细胞划分为不同的细胞周期阶段。G1/S 评分比平均值高至少两倍且 P 值小于 0.01 的细胞被认为处于 G1 期。细胞的 G2/M 评分比平均值高至少两倍，且 P 值小于 0.01，则认为细胞处于 G2/M 阶段。细胞的 G1/S 和 G2/M 评分均比平均值高出至少两倍，且 P 值小于 0.01，则被认为处于 S 期。
细胞周期状态的可视化
研究人员发现，处于非周期性状态、G1 期、S 期和 G2/M 期的细胞在可视化时形成一个近似圆形。这种圆形图案很可能代表了细胞在细胞周期中的持续进展，非周期细胞形成了一个独特的群体。
总之，研究人员可以根据细胞周期相关基因的表达情况，将鼻咽癌肿瘤内的细胞划分到细胞周期的不同阶段。通过了解肿瘤微环境中恶性和非恶性细胞的细胞周期状态，研究人员可以深入了解肿瘤的增殖动态及其对治疗的反应。可视化中观察到的循环模式表明，肿瘤内的细胞周期进展是协调的，这可能对旨在破坏癌细胞细胞周期的靶向疗法有影响。
5-20：CS 计算
细胞得分是**量化一组基因在单个细胞中平均表达水平**的一种方法，既考虑了平均表达水平，也考虑了不同文库复杂性的影响。下面是对这一过程的总结和分析：
基因分选
首先根据基因在所有细胞中的平均表达水平将基因分成 25 个区。这一步将表达水平相似的基因归为一类，有助于创建一个对照基因集，以考虑技术因素导致的表达变异。
创建对照基因集
对于目标基因集（Gt）中的每个基因，从目标基因所属的同一分区中随机选择 100 个基因。这组随机选择的基因构成对照基因集（Gc）。对照基因集的目的是提供一个基线，用于比较目标基因的表达，从而控制同一表达范围内基因的整体表达水平。
细胞得分计算
细胞得分（CSs）的计算方法是**将对照基因组（Gc）的平均表达量减去目标基因组（Gt）的平均表达量**。这种计算方法有助于确定目标基因的表达量是高于还是低于根据同一分区内基因的总体表达水平偶然得出的预期值。
相对表达值的使用
研究人员使用相对表达值来计算 CSs。相对表达值对表达数据进行了归一化处理，以便对不同细胞和样本进行比较。
批量样本 CS
140 个大样本的 CSs 是通过计算基因组的平均表达水平确定的。这一步骤包括将相同的方法应用于批量 RNA-seq 数据（由样本中所有细胞的平均表达量组成），以比较单细胞和批量数据的表达模式。
总之，该工作流程是一种计算细胞得分的复杂方法，既考虑了目标基因的平均表达量，又考虑了文库复杂性带来的技术变异性。通过使用对照基因集，研究人员可以更有把握地将细胞得分的差异归因于生物因素而非技术因素。这种方法对单细胞 RNA 测序数据特别有用，因为单个细胞的表达水平会受到细胞数量和捕获的 RNA 量的影响。将细胞评分应用于大样本，可以对单细胞和大样本 RNA-seq 数据进行比较，这有助于验证研究结果，并为单细胞中观察到的表达模式提供更广泛的背景。
5-21：免疫程序相关梯度
免疫元程序是一组基因，代表肿瘤微环境中的免疫反应。以下是对这一过程的总结和分析：
平均细胞得分计算
研究人员首先计算了所有肿瘤细胞中 9 个肿瘤内免疫程序的平均细胞得分（CSs）。细胞得分反映了基因组的平均表达水平，在这里用来量化免疫程序的活性。
基因排名
根据基因与平均 CSs 的相关性对 9 个肿瘤内免疫程序中的基因进行排序。这种排序有助于**确定与肿瘤内免疫反应关系最密切的基因**。
基因筛选
从排名中选出前 50 个基因作为免疫元程序的候选基因。为确保所选基因与免疫程序不是随机关联，研究人员排除了在肿瘤内免疫程序中出现少于 3 个的基因。这一过程产生了 36 个基因的免疫元程序。
免疫梯度显著性检验
为了测试免疫梯度（肿瘤内免疫反应的变化）的显著性，研究人员随机选择了 36 个基因作为对照基因组，并计算了它们的 CSs。每个肿瘤重复这一过程 100 次。然后将免疫梯度的标准偏差与对照基因组的标准偏差进行比较，以确定免疫梯度是否具有统计学意义。
上皮细胞评分计算
除了免疫元程序外，研究人员还根据上皮细胞相关基因的表达水平计算了上皮细胞得分。该评分可能反映了肿瘤内上皮细胞的丰富程度或活性，这一点非常重要，因为上皮细胞是包括鼻咽癌在内的许多癌症的起源。
总之，该工作流程是定义和验证鼻咽癌肿瘤免疫元程序的一种方法。研究人员根据基因与免疫程序活动的相关性选择基因，并测试免疫梯度的意义，从而确定一组与这些肿瘤的免疫反应可靠相关的核心基因。上皮细胞得分的增加，让人们进一步了解了肿瘤的组成以及免疫细胞和上皮细胞之间的相互作用。这些信息对于了解肿瘤对免疫疗法的反应以及确定潜在的生物标记物或治疗靶点非常有价值。
5-22：与 IS 相关基因的基因组富集分析
GSEA 是一种计算方法，用于确定先验定义的一组基因在两种生物状态（如肿瘤与正常细胞）之间是否存在统计学意义上的显著一致差异。下面是对这一过程的总结和分析：
基因组富集分析（GSEA）
在每个肿瘤中进行GSEA，以**确定在具有特定免疫特征（IS）的细胞中富集的基因组**。GSEA 的工作原理是确定给定基因集中的基因是否更频繁地出现在排序基因列表的顶部或底部。在这种情况下，基因的排序基于它们与肿瘤细胞免疫特征的相关性。
根据相关性对基因进行排序
基因排名指标 "设置为 "皮尔逊 "相关系数。这意味着基因是根据其与肿瘤细胞免疫特征的皮尔逊相关性进行排序的。相关性越高的基因与肿瘤的免疫反应关系越密切。
分子特征数据库（MSigDB）
分析使用了分子特征数据库（MSigDB）中的基因集。MSigDB 是一个注释基因集的集合，可用于 GSEA。提到的特定基因组–“H”、“C2”、“C5”、"C6 "和 “C7”–属于 MSigDB 中的不同类别。
分析参数
除基因排序指标外，GSEA 采用默认参数。使用默认参数可确保分析与既定方法保持一致，从而使结果与其他研究更具可比性。
总之，该工作流程使用 GSEA 来识别肿瘤细胞中富集的具有特定免疫特征的基因集。通过根据基因与免疫特征的相关性对基因进行排序，并使用 MSigDB 中已建立的基因集，研究人员可以深入了解鼻咽癌肿瘤中与免疫反应相关的被激活或抑制的生物通路和过程。这些信息有助于了解肿瘤与免疫系统的相互作用，并有可能发现新的治疗靶点或生物标记物。
5-23：EBV 衍生测序读数的覆盖范围
EBV 是一种与鼻咽癌发病密切相关的病毒。下面是对这一过程的总结和分析：
检索 EBV 读数
研究人员专门从每个单细胞中筛选出映射到 EBV 基因组的读数。这一步骤包括过滤测序数据，重点关注肿瘤细胞中因感染而存在的病毒遗传物质。
覆盖深度计算
使用 "Samtools depth "命令**计算每个细胞的 EBV 基因组覆盖深度。覆盖深度指的是与 EBV 基因组中每个碱基对齐的平均读数，是衡量每个细胞中病毒丰度的一个指标**。
归一化
计算每个细胞 EBV 基因组 100-bp 基因组窗口的平均覆盖率。然后用每个细胞中 EBV 的总覆盖深度对平均覆盖率进行归一化。归一化对于考虑测序深度的差异和确保细胞间覆盖率数据的可比性非常重要。
缩放
归一化覆盖率乘以 1000。这一缩放步骤可能是为了将归一化值转换成更容易解释的比例，如每千碱基读数（RPK）。
圆环图应用
Circos 图是一种圆形可视化工具，用于显示每个肿瘤所有细胞的总覆盖率。Circos 图特别适用于基因组数据的可视化，因为它能以紧凑、信息丰富的方式显示大型数据集。该图沿着圆轴显示 EBV 基因组，每个肿瘤所有细胞的总和覆盖深度用不同的颜色或图案表示。
总之，本工作流程旨在量化和可视化鼻咽癌肿瘤单细胞中的 EBV 基因组覆盖率。通过计算覆盖深度、对数据进行归一化处理以及使用 Circos 图进行可视化，研究人员可以深入了解肿瘤内不同细胞间以及不同肿瘤间 EBV 感染的可变性。这些信息对于了解 EBV 在鼻咽癌发展中的作用以及确定潜在的治疗干预目标非常重要。Circos图提供了一种直观的方法来识别肿瘤细胞中特别丰富或可变的EBV基因组区域，这可能是进一步研究的兴趣所在。
5-24：T 细胞亚群和功能分析
T细胞群提取和整合
使用Seurat软件包从单细胞RNA测序数据中提取T细胞群。Seurat 是单细胞数据降维和聚类的强大工具。
鉴定变异表达基因
变异表达基因是指平均表达量在 0.1 到 4 之间，离散度大于 0.2 的基因。这些基因很可能含有有用的生物信号，并被用于进一步分析。
排除批次效应
由于明显的批次效应，肿瘤样本 NPC63 中的 T 细胞被排除在进一步分析之外。批次效应可能源于技术因素，如样本间不同的处理或测序条件，从而使结果产生偏差。
子簇鉴定
利用 Seurat 的 "FindClusters "功能中基于图的聚类方法识别 T 细胞子簇。确定子簇的分辨率为 0.8，这会影响检测到的簇的数量。
**通过差异表达基因（DEGs）**进行注释
根据差异表达基因（DEGs）对每个 T 细胞亚簇进行注释，差异表达基因是指亚簇间表达水平显著不同的基因。
CD8+ T 细胞发育轨迹分析
为了描述 CD8+ T 细胞的发育轨迹，我们使用了 Monocle2 R 软件包。Monocle2 专为从单细胞 RNA-seq 数据中推断细胞系和发育轨迹而设计。importCDS "函数将 Seurat 对象转换为 Monocle 细胞数据集，"differentialGeneTest "用于测试 T 细胞亚簇间的 DEGs。
功能状态评估
为了评估 CD8+ T 细胞的功能状态，使用了一些细胞毒性相关基因（NKG7、PRF1、GZMA、GZMB、GZMK、IFNG、CCL4 和 CST7）和衰竭相关基因（LAG3、TIGIT、PDCD1、HAVCR2 和 CTLA4）来计算细胞毒性得分和衰竭得分。已知这些基因与 T 细胞功能有关，有助于描述 T 细胞的活性和状态。
总之，该工作流程是分析鼻咽癌肿瘤样本中 T 细胞群的一种复杂方法。通过使用 Seurat 进行降维和聚类，以及使用 Monocle2 进行系谱和发育轨迹分析，研究人员可以深入了解肿瘤微环境中 T 细胞的多样性和功能。细胞毒性和衰竭评分的确定为 T 细胞在肿瘤中的潜在效应和调节作用提供了进一步的信息。这种分析有助于了解肿瘤的免疫反应，并开发有针对性的免疫疗法。
5-25：髓系细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的次聚类
细胞类型提取与整合
从单细胞RNA测序数据中提取髓系细胞、成纤维细胞和ECs，并使用Seurat软件包进行整合，以进行亚聚类分析。Seurat 是单细胞数据降维和聚类的强大工具。
鉴定变异表达基因
变异表达基因是指平均表达量在 0.1 到 4 之间，离散度大于 0.2 的基因。这些基因很可能含有有用的生物信号，并被用于进一步分析。
亚群鉴定
使用 Seurat 的 "FindClusters "功能中基于图的聚类方法识别髓系细胞、成纤维细胞和 EC 的子聚类。确定亚簇的分辨率为 0.6，这会影响检测到的簇的数量。
**根据差异表达基因（DEGs）**进行注释
根据差异表达基因（DEGs）对每个子簇进行注释，差异表达基因是指子簇之间表达水平存在显著差异的基因。
类髓细胞和巨噬细胞
为了描述髓系细胞和巨噬细胞的发育轨迹，我们使用 Seurat 中的 "RunDiffusion "功能构建了扩散图。这些扩散图直观地展示了细胞亚型之间的关系，并能提示不同细胞类型之间的过渡状态。
成纤维细胞
将 Monocle2 R 软件包应用于成纤维细胞的表达数据。importCDS "函数将Seurat对象转换为Monocle细胞数据集，"differentialGeneTest "用于测试成纤维细胞亚簇间的DEGs。
功能状态评估
使用 Monocle2 中的 "plot_cell_trajectory "功能绘制推测轨迹图。这些图有助于**直观地显示细胞亚型的发育或分化状态，从而深入了解鼻咽癌的基本细胞过程**。
总之，该工作流程是分析鼻咽癌肿瘤样本中髓细胞、成纤维细胞和EC的综合方法。通过使用 Seurat 进行降维和聚类，以及使用 Monocle2 进行系谱和发育轨迹分析，研究人员可以深入了解这些细胞类型在肿瘤微环境中的多样性和功能。细胞毒性和衰竭分数的鉴定为了解这些细胞在肿瘤中的潜在效应和调节作用提供了进一步的信息。这种分析有助于了解肿瘤的免疫反应，并有助于开发有针对性的免疫疗法。
5-26：基因组变异分析（GSVA）
通路富集分析是一种统计方法，用于**识别与背景基因组相比，在一组基因中代表性明显过高或过低的通路**。下面是对这一过程的逐步总结和分析：
基因组变异分析（GSVA）
GSVA 是一种计算方法，用于**确定先验定义的一组基因在两种生物状态（如肿瘤细胞与正常细胞）之间是否存在具有统计学意义的一致差异**。它既能处理连续数据，也能处理离散数据，并可应用于各种类型的生物数据，包括基因表达数据，因此是通路富集分析的热门选择。
默认参数
GSVA 分析使用默认参数。使用默认参数可确保分析与既定方法保持一致，从而使结果与其他研究更具可比性。
标志性通路
分析使用了分子特征数据库（MSigDB）记录并在 GSEABase 软件包中实现的 50 条标志性通路。这些通路代表了定义明确的生物过程，并被用作参考集，用于比较鼻咽癌肿瘤样本中通路的活性。
总之，本工作流程使用 GSVA 来识别鼻咽癌肿瘤样本中与一组标志性通路相比明显富集或贫化的通路。通过使用默认参数和一套完善的参考通路，研究人员可以深入了解肿瘤细胞中活跃或不活跃的生物过程。这些信息有助于了解鼻咽癌的分子机制，并确定潜在的治疗目标或生物标记物。
5-27：处理大量 RNA-seq 数据
获取数据
从基因表达总库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载了113个样本的批量RNA-seq原始数据，登录号为GSE102349。此外，还包括 Hu 等人的 9 个样本的数据，以及 18 个新测序的样本。这样，共有 140 个鼻咽癌样本可供分析。
无进展和总生存期数据
在 140 个样本中，112 个样本有无进展生存数据，105 个样本有总生存数据。这些生存数据对于将基因表达模式与临床结果联系起来至关重要。
批量 RNA-seq 数据处理
使用TopHat（2.1.1版）和默认参数将批量RNA-seq数据中的成对端读数映射到人类-EBV混合基因组。TopHat 是一种转录本比对工具，可将 RNA-seq 读数与参考基因组比对。在这种情况下，参考基因组包括人类和 EBV 序列，反映了病毒序列在鼻咽癌中的整合。
基因表达定量
Cufflinks（2.2.1 版）工具套件用于**量化基因表达水平**。将 Cuffquant 应用于每个样本的 BAM 文件（由 TopHat 生成的比对文件），以计算基因和转录本的表达水平。
数据合并与归一化
使用 Cuffnorm 对所有样本的结果进行合并和归一化，以生成最终的表达矩阵。归一化对于考虑测序深度的差异和确保样本间表达数据的可比性至关重要。
总之，该工作流程整合了 scRNA-seq 数据和大量 RNA-seq 数据，以研究鼻咽癌 TME 的组成。通过结合这些数据类型，研究人员可以深入了解单个细胞内的异质性和肿瘤的整体转录组景观。通过整合生存数据，可以探索基因表达模式与患者预后之间的关系。这种综合分析有助于了解鼻咽癌的生物学机制，并确定潜在的治疗目标或生物标记物。
5-28：解密NPC的 TME 组成
确定细胞类型特异性标记
研究人员首先**利用 10x Genomics 数据确定了鼻咽癌 TME 中不同非恶性细胞类型的标记物**。他们重点研究了6种数量最多的细胞类型： T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞（EC）。
候选标记选择
使用 10x Genomics 提供的 Loupe 细胞浏览器，提取在某些细胞类型中差异表达的前 50 个基因作为候选标记集。这一步骤包括对数据进行筛选，以找到在特定细胞类型中上调或下调最一致的基因。
表达阈值
在每种细胞类型中平均表达量小于 0.2 的基因被排除在每个候选标记集之外。该阈值用于确保所选基因具有足够高的表达水平，从而成为有用的标记。
手动审查和验证
研究人员使用 Loupe 细胞浏览器手动审查候选标记物的表达模式。这一步对于确认所选基因确实是特定细胞类型的特异基因，而不是其他细胞类型表达的基因至关重要，因为其他细胞类型可能会导致错误分类。
最终细胞类型特异性标记
经过人工审核后，符合标准的基因被视为最终的细胞类型特异性标记物。这些标记列于补充信息表 S9。
TME组成解密
利用这些细胞类型特异性标记物，研究人员通过批量 RNA-seq 数据破译了 140 个鼻咽癌样本的 TME 组成。具体方法是根据大量 RNA-seq 数据中标记基因的表达水平，估计每种细胞类型的相对丰度。
K-Means 聚类
所有 140 个鼻咽癌样本根据其 TME 组成情况使用 **K-means 聚类**方法分为 5 组。K-means 聚类是一种常见的无监督学习方法，用于将数据集划分为 k 个聚类，使聚类内的方差最小。
总之，该工作流程是一个多步骤过程，首先从 10x 基因组学数据中识别细胞类型特异性标记物，最后利用批量 RNA-seq 数据解密 140 个鼻咽癌样本的 TME 组成。通过使用 k-means 聚类，可以根据细胞类型相对丰度的相似性对样本进行分类，从而深入了解鼻咽癌 TME 的异质性。这种分析有助于了解肿瘤内部复杂的相互作用，并确定潜在的治疗干预靶点。
5-29：推断肿瘤细胞特异性表达
细胞类型特异性基因表达
使用**细胞类型特异性基因的平均表达水平来估算肿瘤微环境（TME）中每种细胞类型（包括恶性和非恶性细胞）的相对丰度**（Ar(t)）。
多重线性回归
该表达水平受恶性和非恶性细胞的影响。
基因特异性和细胞类型特异性比例因子
该方程包括基因特异性和细胞类型特异性缩放因子（X(t,g)），用于最小化残差（R(i,g)）的平方和。缩放因子用于调整基因和细胞类型之间表达水平的差异。
推断癌细胞特异性表达
多元线性回归的残差代表观察到的表达水平与预测的表达水平之间的差异，被认为是推断的癌细胞特异性表达。这种表达是肿瘤细胞特有的，并考虑了非恶性细胞的贡献。
总之，这种方法**利用多元线性回归从大量 RNA-seq 数据中减去免疫细胞和非恶性细胞的表达，从而分离出肿瘤细胞的特异性表达**。通过考虑细胞类型的相对丰度并使用基因特异性和细胞类型特异性比例因子，研究人员可以更准确地估计免疫细胞和非恶性细胞对肿瘤整体表达的贡献。这种方法有助于了解肿瘤的免疫细胞和基质细胞组成，并确定潜在的治疗目标或与肿瘤细胞相关的生物标记物。
5-30：不同类型细胞之间的相互作用
配体-受体相互作用列表
研究人员从先前研究中获得的配体-受体配对的已知列表开始。该列表提供了一组已知存在于各种细胞类型之间的相互作用分子。
表达分析
利用 10x Genomics 数据中的 Seurat 归一化表达矩阵，研究人员调查了配体和受体在不同细胞类型中的表达情况。他们寻找一种细胞类型（细胞类型 A）表达的配体，而另一种细胞类型（细胞类型 B）表达了相应的受体。
表达阈值
如果配体或受体在某些类型细胞中的平均表达值大于 0.2，则认为该配体或受体已表达。该阈值用于确保所选基因具有足够高的表达水平，从而成为有用的相互作用标记。
相互作用事件计数
对于配体和受体均达到表达阈值的每一对配体-受体，均视为 A 和 B 两类细胞之间有效的相互作用事件。
肿瘤细胞相互作用
研究人员重点关注涉及肿瘤细胞的相互作用。当肿瘤细胞表达的受体或配体与另一种细胞类型表达的配体或受体相互作用时，他们就计算了有效的配体-受体相互作用。
传入和传出事件
相互作用进一步分为传入和传出事件。当肿瘤细胞表达的受体与另一种细胞类型表达的配体相互作用时，即为传入事件。当肿瘤细胞表达的配体与另一种细胞类型表达的受体相互作用时，就发生了传出事件。
总之，该工作流程是一种系统化方法，用于识别和量化鼻咽癌 TME 中不同细胞类型之间的潜在相互作用。通过关注配体与受体之间的相互作用并使用表达阈值，研究人员可以确定 TME 中哪些细胞能够与肿瘤细胞相互作用。这些信息有助于了解肿瘤内复杂的细胞相互作用，并确定可用于破坏这些相互作用的潜在治疗靶点或生物标记物。
5-31：调查与细胞丰度相关的基因
细胞类型丰度定义
根据大量表达谱中细胞特异性标记基因的平均表达水平，定义肿瘤微环境（TME）中每种细胞类型的丰度。这一步骤包括识别在特定细胞类型中持续**上调或下调**的基因，并用它们作为标记来估计该细胞类型在 TME 中的相对丰度。
相关性计算
计算基因与某些细胞类型丰度之间的相关性。这些相关性有助于深入了解与每种细胞类型相关的生物过程，并有助于确定可能介导细胞类型之间相互作用的基因。
与 scRNA-seq 数据比较
利用单细胞 RNA-seq 数据，将每个基因在与之相关的细胞类型中的表达水平与其在其他细胞类型中的表达水平进行比较。通过这种比较，可以验证批量数据中确定的相关性，并确定细胞类型之间基因表达的差异。
差异表达分析
差异表达（DE）基因被定义为两种细胞类型之间对数2转换表达比大于2或小于-2的基因。这些基因很可能含有有用的生物信号，并被用于进一步分析。
基因-细胞类型相互作用中介
研究人员**重点关注与一种细胞类型的丰度高度相关，但在另一种细胞类型中表达不同的基因**。这些基因是介导两种细胞类型之间相互作用的潜在候选基因，因为它们可能在调节这些细胞之间的交流或相互作用方面发挥作用。
总之，该工作流程是一种复杂的方法，用于分析大量和单细胞 RNA-seq 数据，以确定鼻咽癌 TME 中潜在的基因-细胞类型相关性和相互作用。通过结合大量数据来估算细胞类型丰度，结合单细胞数据来验证相关性并识别 DE 基因，研究人员可以深入了解与每种细胞类型相关的生物学过程，并识别可能介导细胞类型间相互作用的基因。这些信息有助于了解肿瘤内复杂的细胞相互作用，并确定可用于破坏这些相互作用的潜在治疗靶点或生物标记物。
5-32：分析不同细胞类型之间选定的配体-受体对
相互作用水平评估
两种细胞类型之间的相互作用水平被定义为一种细胞类型中配体的平均表达水平与另一种细胞类型中相应受体的平均表达水平的乘积。这一指标**根据相互作用分子的丰度对相互作用的潜力进行定量测量**。
显著性突变检验
为了评估特定相互作用的统计意义，我们进行了一次置换检验。这包括将所有细胞的数据集随机洗牌 1000 次，产生相互作用水平的背景分布。然后根据该背景分布计算出每种相互作用的 P 值，表明观察到的相互作用偶然发生的可能性。
配体和受体的表达阈值
配体或受体必须在特定细胞类型中至少有 5%的细胞表达，才能考虑进行相互作用分析。如果配体/受体不符合这一标准，即使排列测试表明交互作用显著，也会被视为不显著。使用这一阈值是为了确保相互作用不是基于单个离群细胞。
数据解释
交互作用水平和计算出的 P 值用于解释配体-受体在两种细胞类型之间的交互作用程度。P 值越低，表明相互作用发生的偶然性越小，表明发生真正生物相互作用的可能性越大。
总之，该工作流程是一种量化鼻咽癌 TME 中不同细胞类型之间配体-受体相互作用可能性的方法。通过将基于基因表达水平的相互作用定量测量与统计显著性的置换检验相结合，研究人员可以确定可能具有生物学基础的相互作用。这些信息有助于了解肿瘤内复杂的细胞相互作用，并确定可用于破坏这些相互作用的潜在治疗靶点或生物标记物。
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