微生物检验技术考试要点(整理-中级)

最新推荐文章于 2025-04-25 15:24:01 发布

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检验技术资格考试考点精要

1. 生物学按界门纲目科属种分类，种是最小单位。病毒分类：目、科、亚科、属、种。属名--VRirus结尾的单词,亚科名--VRirinae结尾的单词,科名--VRiridae结尾的单词。目名—VRirales。2004年ICTV公布病毒分为：73个科、11个亚种、289个属。

2. 结核菌可利用甘油为碳源，梭状芽胞菌可以氨基酸为碳源，流感嗜血杆菌要Ⅴ，Ⅹ因子才能生长。

3. 药物敏感试验：纸碟法、小杯法、凹孔法、试管法。常用单片纸碟法、试管稀释法（以抗菌药物的最高稀释度仍能抑制细菌生长或杀菌管为终点，该管含药浓度为最低抑菌浓度MIC或最低杀菌浓度MBC），两值越低则表示越敏感。MIC与抑菌圈呈负相关，即抑菌环直径越大，MIC越小。

各药敏纸片间距不少于24mm，距平板内缘不小于15mm。

药物敏感实验判定标准：抑菌圈直径（毫米）：20以上极敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏。不同的菌株、不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。

多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

4.常用的免疫技术：酶免疫技术（EIA）、协同凝集试验、免疫荧光技术（IF）、对流免疫电泳（CIE）、免疫印迹技术。

5.病原菌核酸的检测：核酸杂交、PCR技术、基因芯片技术。

PCR技术—是选择DNA或RNA体外扩增技术，用标本提取DNA为扩增模板，选用一对特异寡核苷酸为引物，PCR一般要经历三十多次循环，经不同温度变性93-94℃（作用1min氢键断裂形成单链DNA）、退火40-60℃（迅速冷却30-60s引物与DNA模板结合，形成局部双链）、延伸70-75℃（在TaqDNA聚合酶作用下，以A、T、G、C四种脱氧核苷酸为原料，从引物5’→3’端延伸，合成与模板互补的DNA链。），扩增产物用溴乙啶染色的凝胶电泳。其具有特异、快速、灵敏、特异性强、操作简便、能够定量。引物是PCR特异性的决定因素，PCR反应中TaqDNA聚合酶、引物加量过多，可引起非靶序列扩增。

变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低。2）溶液旋光性发生改变。3）增色效应。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"，Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件。核酸实验中经常以迅速冷却至4℃以下方式保持DNA的变性(单链)状态。

基因芯片技术（DNA芯片、DNA微阵列）—主要过程：DNA微阵列的制备、样品的制备、靶分子和探针之间的杂交、杂交信号的检测与分析。具有快速、敏感、高通量检测平台。

核酸杂交（基因探针杂交技术）--是指单链RNA和DNA或DNA和DNA或RNA和RNA，根据碱基配对原则，借氢键相连而形成杂交分子的过程。杂交百分率＞70%（≥69%）为高度同源性，同源性在60%以上是一个种，同源性在60%--70%是同一种内不同亚种，同源性在20%--60%同一属内不同菌种，同源性

20%≤不同属的菌种。

AFLP的含义是----扩增片段长度多态性。有很大功能的DNA指纹技术。一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。

6.细菌诊断流程有：双岐索引法，表解法，数字编码鉴定法。致病性岛：由基因编码决定的一团与致病性相关的基因组。

7. 病原细菌确定原则：（郭霍Koch原则）1、从一种疾病病人中能有规律地发现一种细菌2、能够分离这种细菌获得纯培养3、把这种细菌的培养物引入易感动物体内，可以引起与病人类似的疾病4、在实验感染引起的疾病中仍然能够分离同一种细菌。

8. 杆菌肽用于A（敏感）与非A群链球菌的鉴定。O/129抑菌试验对弧菌有用而对气单胞菌无用。

9. 奥普托欣试验：肺炎链球菌敏感。

10. 杂交分：斑点，菌落原位，Southern（DNA）印迹，Northern（RNA，DNA）印迹。

11. L型细菌：细胞壁缺陷（形态多样，染色不定，可过滤，渗透压敏感，生化减弱等）培养应高渗透压（3-5%氯化钠、20%蔗糖），琼脂浓度0.5以下半固体培养基。染色多为G染阴性，形态不一（巨球形是特征），固定要用10g/L鞣酸不能用火焰。

增殖：以二分裂、出芽、巨形体释放颗粒方式。一般菌落有：油煎蛋样（L），颗粒型（G），丝状菌落（F），鉴定要点：染色易变多形性，生长在增菌液中微浑，颗粒样沉淀或沿试管壁生长，返祖现象。致病特点：慢性和反复发作性感染，致病物质是毒素。L型细菌在体内体外都可形成。原生质体与原生质球都是细胞壁缺陷的细菌。

12. 细菌的突变：基因突变（又称点突变；有碱基对的置换、插入、或缺失、错码）、染色体畸变（易位、倒位、重复、缺失）。突变：自发突变、诱发突变。质粒在细菌的自发突变中起重要作用。细菌质粒在重组DNA技术中常用的载体。质粒的分离提纯使用酚处理，用乙醇沉淀。

13.噬菌体--是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，专性胞内寄生，有严格的宿主特异性。由核酸和蛋白质组成。大多数DNA噬菌体的DNA为线状双链（有尾噬菌体的核酸）；RNA噬菌体的RNA为线状单链（无尾噬菌体的核酸为环状单链DNA或线状单链RNA）。对紫外线敏感10-15分钟失去活性。噬菌体分毒性噬菌体、温和噬菌体（溶原性噬菌体）；毒性噬菌体以复制方式增殖，过程吸附、穿入、生物合成、成熟与释放，少脱壳。在液体培养基中使混浊菌液变澄清，在固体培养基上形成噬斑。温和噬菌体---是噬菌体基因组整合于宿主菌染色体中，有溶原性周期、溶菌性周期。噬菌体可以根据不同细菌的表面受体来裂解目标菌---是判定某些种类病原体的重要依据。

14. 肽聚糖的结构由聚糖骨架，四肽侧链和五肽交联桥（G－无交联桥）。磷壁酸为G＋特有，分壁和膜两种。外膜层由脂多糖，脂质双层，脂蛋白组成。细胞质内有核蛋白体（蛋白合成地），核质（主要遗传物质）质粒，胞质颗粒，是细菌蛋白质和酶类合成的重要场所。鞭毛是由细胞质伸出的蛋白性丝状物。性菌毛仅有1～10根，毒力和耐药质粒都能通过它转移，有致病性。

15. 免疫器官：骨髓、胸腺、脾、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾和黏膜免疫系统。免疫细胞：淋巴细胞、单核吞噬细胞、中性粒细胞、嗜酸嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板。免疫分子：补体、免疫球蛋白、细胞因子

中枢免疫器官：骨髓、胸腺、鸟类法氏囊。外周免疫器官：淋巴结、脾和粘膜相关淋巴组织

特异性免疫：体液免疫、细胞免疫。

体液免疫：（B淋巴细胞介导，CD4+Th辅助，Th2细胞能分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）；效应是抗体（Ab）；1、病毒中和抗体（不能直接灭活病毒，IgG、IgM、IgA）2、血凝抑制抗体（HLAb）3、补体结合抗体。

IgG在体液中含量最多，分子量小是唯一能通过胎盘的抗体。IgM分子量大，是最早产生的抗体，中作早期诊断。IgA存在黏膜分泌液中，在局部可阻止病毒侵入，能抵抗蛋白酶的水解作用，具局部抗体。IgE可与肥大细胞膜上的Fc受体结合。

补体C：存在血清中，不耐热，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件。由9种成份，11种蛋白组成。补体激活两个途径：传统途径（一）---被Ag-Ab免疫复合物IC活化，顺序C1、C4、2C、3C、5C、6C、7C、8C、C9。旁路途径（二）---被细胞的脂多糖激活。补体激活---酶促级连反应。

细胞免疫（T淋巴细胞介导，效应细胞：细胞毒性T细胞（CTL）、CD4+Th1细胞、CD8+毒性T细胞CTL）。Th1细胞诱导产生迟发型超敏反应（DTH）

16.测特异性抗原最常用实验：凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验、胶体金免疫吸附试验

17. 细菌营养转运的方式有：离子，透性酶，磷酸酶。营养物质进入机体的方式：易化扩散、主动运转（由透性酶完成）、基团移位（糖类由磷酸酶磷酸化进入胞内，不能再透出菌体）。

18. 细菌生长繁殖的条件:充足的营养、适宜的温度、合适的酸碱度、必须的气体环境。细菌生长的温度极限-7--90℃：嗜冷菌最适温为10～20℃，嗜温菌为20～40℃，嗜热菌为50～60℃。适宜的酸碱度PH7.2—7.6。细菌生长繁殖分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期

19.（肠道杆菌）细菌的四种生化反应：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C），合称为IMViC。大肠杆菌呈++--，产气杆菌呈--++。还需做糖发酵试验，KIA产酸产气，MIU＋――，有菌体（O）荚膜（K）鞭毛（H）三抗原。肠杆菌科分型多采用苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验。可疑菌分别接种克氏双糖铁（KIA）尿素靛基质动力（MIU）来定属。

细菌代谢所需能量主要以生物氧化作用而来。细菌新陈代谢的产物：热原质、毒素与酶、色素、抗生素、细菌素。热原质除去的最好方法---蒸馏。内毒素（G-脂质A）、外毒素（G+产生的毒性蛋白质产物，具有抗原性强、毒性强、作用特异性强、不耐热、人工化学可脱毒性，0.4%甲醛脱毒后形成类毒素进行人工免疫）。据亲和性及作用靶点分为:神经毒素、细胞毒素、肠毒素。细菌的内毒素一般由：脂质A（主要成份），非特异性核心多糖，菌体特异性多糖。一般7～10天后机体产生特异性免疫。IgG和IgM能在血中直接中和病毒。

热原质：脂多糖，多由G-产生，耐高温，可引起发热反应，高压蒸气灭菌（121℃20分钟）使其破坏。

20. 细胞壁的作用：承受胞内高渗压、支持细胞膜、维持细菌形态；是鞭毛运动的支点。

细胞壁的主要成份：肽聚糖（又称黏肽、胞壁质），是原核生物特有的成份，能破坏肽聚分子结构或抑制其合成的物质，都有抑菌和杀菌作用。

G-菌细胞壁的主要成份：肽聚糖、脂蛋白、外膜、脂多糖（LPS）（类脂A、核心多糖、特异性多糖），菌体脂多糖（LPS）能引起发热故称热原质，又称为细菌的内毒素。

细胞膜的主要功能：物质纳泄、生物合成、呼吸作用、形成中介体。

细胞质中的异染颗粒主要成份：RNA、多偏磷酸盐

21.有芽胞破伤风菌需沸水煮3h才杀死。水中加入2%碳酸钠能将沸点提到105℃又能防止金属生锈。

22. 紫外线波长265～266nm时杀菌力最强。日光灯波长约0.5µm。

23. 滤菌器用于除菌的孔径是0.22µm，另外以石棉板为滤板的金属滤器称Seitz滤器（蔡氏滤器）按滤孔大小分K：最大，澄清用，EK-S最小，可阻止大病毒通过EK：居中，除去一般细菌。玻璃滤菌器分G1～G6，G5，G6两型能阻止细菌通过。

24. 高压灭菌指示物：嗜热脂肪芽胞杆菌（ATCC 7053），紫外线杀菌指示物：枯草芽胞杆菌黑色变种（ATCC 9372）。

25. 细菌遗传物质主要在于染色体、质粒和转位因子中。质粒：不依赖染色体而复制，不相容性，转移性，指令性，大多数质粒在自然状态下是一种闭合环状双链DNA。主要有耐药质粒，Col质粒（编码肠毒素）Vi质粒（编码细菌与致病性有关的蛋白）。转位因子为存在于细菌染色体或质粒上的一特异的核苷酸序列可在DNA中移动，主要有三类：插入顺序（最小的转位因子），转座子，转座噬菌体。

质粒载体具有特点：复制起点、抗菌素抗性基因、多种限制酶的单一切点、较高的拷贝数

26.病毒的特性：1、只含一种核酸2、基因组复制3、缺乏完整的酶系统4、RNA病毒的RNA经反转录合成互补DNA（CDNA）。甘油（10％）或10%二甲基亚砜的血清作悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞，在干冰温度（-70℃）和液态氮温度（-196℃）下长期保存其感染性；将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中，解冻做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。PH5-9稳定；射线和紫外线、X线、r线能灭活病毒。病毒学上常用的细胞类型：原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。

27. 超净工作台应采用层流技术净化空气、选择垂直气流通风方式。洁净度可达百级，只保护样品。

28.菌体蛋白电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带正电。

29.染色程序及方法：制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。

革兰染色法：初染（草酸铵结晶紫）、媒染（碘液）、脱色（95%酒精）、复染（番红）。

抗酸染色法：5%石炭酸复红、5%盐酸酒精脱色、美兰复染。

芽胞染色：菌悬液→孔雀绿→水浴15-20分钟→涂片→干燥→固定→水洗脱色→番红或稀释石炭酸复红复染→水洗→晾干

荚膜染色：（负染色法、墨水法）。负染色法：制片（蒸馏水+菌）→干燥（晾干）→染色（复红）→水洗→干燥（晾干）→涂墨素。背景灰色、菌体红色、荚膜无色透明

鞭毛染色---镀银法；媒染A液—10%单宁酸10ml+5ml饱和硫酸钾铝水溶液+1ml苯胺饱和水溶液+5%氯化铁水溶液成墨色。银染B液—5%硝酸银+浓氨水（比重0.88）成薄雾状。

制片（蒸馏水+菌）→干燥（晾干）→染色（A液3—5分钟）→水洗→干燥（晾干）→染色（B液稍加热分30—60秒）→水洗→干燥（晾干）。菌体深褐色、鞭毛褐色。

30.病毒吸附蛋白（VAP）；血凝素（HAs）。病毒的复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成及组装、成熟和释放

31.病毒突变株分：条件致死性突变株，空斑和宿主依赖性。遗传型变异机制有突变，基因转移，重组。突变：突变率由复制的准确度，DNA发生损伤的机会，及对损伤DNA修复程度来决定。

32.非特异性免疫：干扰素（IFN）、NK细胞。干扰素（IFN）--具有广谱抗病毒作用，只能抑制病毒，即通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。

33.小淋巴细胞分为：T细胞、B细胞、K细胞。T细胞来自骨髓，在胸腺成熟。在人体血液中T细胞占淋巴细胞总数的60—70%，；在胸导管则占95%以上。B细胞第一个合成产物是u链。

34.碱基的置换：嘌呤换嘌呤，嘧啶换嘧啶为转换，嘌呤换嘧啶为颠换。影响基因表达的因素有：调控部位，调节蛋白，效应分子。

35.转化：受体菌直接摄取供体菌提供的游离DNA片段，整合重组（与染色体重组）使受体菌的性状发生变异。一般有链，嗜血，芽胞菌有此功能。

36. G＋菌等电点pI=2～3，G－菌等电点pI=4～5。RNA主要存在于细胞质中占细菌干重的10%，DNA存在于染色体和质粒中。G+菌的感受态是由感受态因子（CF）的胞外信号诱导的。

37. 转导：以噬菌体为媒介，将供体菌的基因转移到爱体菌内而致受体菌基因改变，分普遍和局限。

38. 接合：受体菌和供体菌直接接触，供体菌通过性菌毛所带的F质粒或类似遗传物质转移到受体菌。

39. 溶源性转换：是噬菌体的DNA与细菌染色体重组，使宿主遗传结构发生变异。

40. 原生质融合：两种经过处理失去细胞壁的原生体混合和可发生融合后的双倍体可发生染色体间的重组。

41. 基因重组可使基因再激活表现为：交叉复活和多重复活。

42. 粘附素是细菌表面的蛋白质有菌毛和非菌毛。进入宿主：黏附，定植，侵入，转归。毒力有侵袭力和毒素。

43.侵袭力：菌体表面结构，菌毛，侵袭性酶（凝固酶，透明质酸酶，链激酶，胶原酶等）。是指病原突破宿主机体的防御功能，并能在体内定居、繁殖和扩散的能力。

45.细菌种的科学命名采用拉丁文种属双命名法，前一字为属名，名词，后一为种名，形容词。目前国际上普遍采用伯杰分类系统，也有用CDC（USA）。目前以细菌细胞壁的结构特点作最高一级分类依据将原核界分为薄，坚，软，疵壁四门。科，属，种分类主要依靠生化特性和抗原结构。

46. 显微镜的分辩率为波长一半。荧光显微镜的光源为超高压汞灯（50—200W）。

47.油浸物镜的工作距离一般是0.2mm。普通光学显微镜不能观察细胞和细菌的亚结构。相差显微镜特殊装置—--环状光阑、相板，利用光干涉现象。适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况、及细微结构的观察。用绿色滤光片。

48. 不能立刻接种的血应用SPS（氯化钠溶液）抗凝。怀疑细菌性心内膜炎时血培养不少于三次。

49. 肠杆菌科的强选择（SS琼脂）弱选择（EMB，麦康凯）。

50. 直接镜检2h报告，最后鉴定和药敏一般不过3天，除血外，必须在24h内预报

53. α溶血是草绿色，β溶血是透明环，γ溶血红细胞不溶解，双环。

54. 细菌数量达106~107CFU/ml时培养肉汤才见混浊。

55. 血培养中有105菌落形成单位（CFU）/ML时才能通过革兰氏染色检出细菌。

56. AMS系统是目前微生物鉴定中最常用的自动化仪器。

57. 突变种纯系动物：实验动物正常染色体中某个基因发生了变异的具有各种遗传缺陷的突变品系动物。

58. 纯***动物：无计划随意交配的动物。近交系动物：采用兄妹交配（或亲子交配）繁殖20代以上的纯品系动物。无菌动物：体表肠道内无菌、体内无抗体。悉生动物：给出无菌动物引入已知的5～ 17种正常肠道菌的动物。

59. 小白鼠对肺链，破伤外毒素敏感，豚鼠对结核白喉易感，猫对金葡萄菌肠毒敏感。测定病原体的感染性最好选用无菌动物或悉生动物。

60. 菌种保存：“冻干”保存—稳定剂（脱脂乳、蔗糖）。冻干菌种只能使用一次，冻干菌种打开后需要以传代保存形式保留工作菌种。冻干菌种在使用时须“复苏”且须传代才能恢复原生长特性。低温保存：-20℃或-80℃+甘油作稳定剂。菌种取出须置于干冰或预冷的铅质容器内，用完立即放回不可菌种解冻。冷冻干燥保存法是最有效的方法，利用各种斜面和半固体加石蜡油是最常用和最简便的方法，一般不含糖，不用液体。

61. 在细菌生长到足够量时加入抑制蛋白质合成的抗生素，在细菌停止繁殖后质粒还在复制，可以提高质粒的收获量。

62. 粪便呕吐物应接种高盐卵黄或高盐甘露醇琼脂，触酶阳性，凝固酶阳性玻片法筛选，试管法确证。必须做苯唑西林的敏感试验。

63. 真菌，霍乱，铜绿及粪碱需在室温保存，而脑膜炎，淋球，初次分离的流感嗜血菌保存于37℃。每转种三代要鉴定一次。

65. 葡萄球菌：产生脂溶性色素，多数分解甘露醇产酸液化明胶和产生血浆凝固酶。蛋白抗原（A蛋白）种属特异无型特异，多糖抗原（A，B，C）是半抗原，有型特异。是抵抗力最强的无芽胞菌。

66. 布鲁司菌：无鞭无芽G-呈散沙状，S型有荚膜，专性需氧，抵抗力强，37 ℃，PH6.6～6.8，血液、血清、肝浸液可促进生长，48小时形成微小，无色透明光滑凸起菌落。6个种19个生物型，对人致病是羊、牛、猪种。血清凝集试验（SAT）是常用诊断实验，虎红平板凝集试验（RBPT），补体结合试验（CFT）、免疫荧光试验（IFT）等。静脉血3—5毫升。用肝浸液琼脂培养基、蛋白胨、土豆浸液琼脂等。动物分离—豚鼠。生化特征：分解尿素、产生硫化氢。

诊断标准：血清试管凝集试验（SAT）1：100++以上，补体结合试验（CFT）：1；10++

67. 莱姆病原：伯道疏螺旋体引起莱姆病，细胞结构：原生质柱、表层、外膜、鞭毛。微嗜氧G-，能自身合成类脂化合物、主要脂肪酸，并将嘌呤碱结合到核酸中，但不能合成长链脂肪酸，发展酵代谢产物---乳酸。蜱传播媒介，鼠主要宿主动物，标本在 -20—4℃运送。

标本制成悬液，暗视野显微镜20×10或40×10下检查。

病原分离：接种BSK培养基33℃培养。用兔抗B31特异性多克隆抗体进行间接免疫荧光抗体试验（IFA），或ELISA、WB---最终确诊方法。

68. 钩端螺旋体：原核细胞型微生物，双股DNA。需氧或微需氧，是致病性螺旋体中唯一能人工培养的。其中鼠类和猪为主要的传染源和储存宿主，通过人的皮肤黏膜侵入。常用柯夫培养基或EMJH培养基，需加入10%兔血清或牛血清，培养液透明有轻度乳光，摇动时有云雾状混浊。G-Fontana镀银染色成棕色。对酸碱敏感，最适是PH7.2～7.5，低于6.8，高于7.7生长不良，最适温28～30℃，12h分裂一次。电镜下基要本结构：柱形原生质体、内鞭毛、外膜

标本：血液、脑脊液在发病后10天内，出现发热但未用药前，不能即时送检，血液用不含枸橼酸钠抗凝5-20℃保存，1周内接种。2周取尿液则用1%牛血清白蛋白保存，用磷酸盐缓冲液稀释取50微升接种到5毫升培养基中每个稀释度2管，每管中先加入30微克新霉素滤纸片或每毫升培养基加5-氟尿嘧啶200-400微克。暗视野显微镜检查每周1次连5周，阴则每月2次连4月。

病原鉴定：血清群用显微凝集试验（MAT），血清型用交叉凝集吸收试验，分子生物学技术。

69. 致病性链球菌：沉淀生长（肺链为混浊），在含腹水的培养物上生长良好，溶血株呈絮状或颗粒状生长，不溶血株呈均匀混浊生长。

（一）化脓性链球菌：标本1天内送，不超过2天。THB增菌肉汤、5%脱纤维羊血的胰酶消化大豆琼脂培养基，血液和脑脊液应先增菌后接种平板，脓液、咽拭子直接种于血平板。

A群链对杆菌肽敏感青霉素G为首选，抑环＞10cm敏感。(90%对人致病)

B群链CAMP试验阳性（鉴定指标35℃卵育），马尿酸钠水解试验阳性

D群链七叶甘水解试验变黑色为阳性，6.5%氯化钠生长试验(黄色)

快速检测:酶标免疫测定法、PCR（A群链致热外毒素A，B，C基团speA，speB，speC各溶血素O基团slo）。抗溶血素O抗体---溶血法、胶乳凝集法。

（二）肺炎链球菌：37.5℃pH 7.4—7.6初次CO2卵育, 在含3%～5%的兔血清中生长良，血平板上草绿色a溶血环。如G+具有矛头状双球菌可初步诊断。培养时间过长会自溶管底澄清，以奥普托欣试验、分解菊糖，胆汁溶菌阳性区别于甲型溶血性链球菌。主要抗原有：蛋白质抗原、多糖抗原、核蛋白抗原。胆汁溶菌试验---0.5ml生理盐水细胞悬液制成相当于0.5麦氏单位的密度标准。

取细胞悬液0.25ml+0.25ml 2%的脱氧胆酸35--37℃培养2小时，管液清澈或浊度消失为阳性。

氨基糖苷类合用，β溶链致病性最强，α溶链为条件致病菌。几乎所有的肺链对Optochin敏感。

（三）猪链球菌：人感染致病：脑膜炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克。35个血清型。2型致病其属于R群，属特异基团tuf、种特异基团16SrRNA

70. 肠球菌属：能在高盐（6.5% NaCl）高碱（pH 9.6）40%胆汁培养基上和10～45℃生长，是G+菌中仅次于葡萄球菌的重要院内感染病菌。临床上分离最高的是粪肠球菌，可分庆霉素高耐药和低耐药，一般用β-内酰胺类和氨基糖苷类联合。

71. 脑膜炎奈瑟菌：脑液中位于中性细胞内，大多能分解葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气，具有氧化酶和触酶。能产生自溶菌不宜冰箱应立即保温送检，冬末春初为流行高峰，青霉素G为首选。依据荚膜分13个血清型，主要是ABC三个血清型及W135、Y。通常采3管脑脊液（化学、微生物、细胞学）含添加剂的巧克力平板（CAP）和血琼脂平板（BAP），如不能立即接种，，则接种至预热35℃的转运—分离（TI）培养基中保温通气，可保存7天，血液采集后1分钟内注入肉汤中。

镜检：脑脊液2000r/min离心20分钟，沉淀物镜检脑膜炎双球菌常在多核白细胞内或细胞外。病原鉴定：Kovac氧化酶实验10秒内呈紫色阳性反应。

快速检测：乳胶凝集试验测抗原。上清液可—20度冻存长时间。

72. 淋球奈瑟菌：G-人类是唯一天然宿主和传染源。不耐干燥，35—36℃，2.5—5%CO2生长,最适pH7.5，对糖类生化最低只能发酵葡萄糖，主要有菌毛蛋白，脂多糖，外膜蛋白抗原。细菌培养是目前世卫推荐的唯一方法，用培养法查女病人宫颈口表面分泌物。培养基中应含万古霉素、多粘菌素B。标本接种在巧克力血琼脂平板或T-M培养基。急性期淋病菌常在白细胞内，慢性期淋病菌常在白细胞外，在中性粒细胞内有G-性双球菌具有诊断价值。

73.梅毒病原：菌体形似弹簧，运动活泼，两端尖直，有细胞壁和膜，原生质圆柱体且有3-4根周浆鞭毛，G-抵抗力极弱，对青霉素、四环素、红霉素、砷剂敏感。

标本：Ⅰ期梅毒取下疳渗出液（20分钟内查）；Ⅱ梅毒取梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液；先天性梅毒取脐血；神经梅毒取脑脊液。

镜检：新鲜标本加盖片暗视野显微镜下检查，浆液不能含有红细胞、微生物、组织碎片。荧光标记、ELISA普光下查，镀银染色螺旋体染成棕褐色光镜下查。

病原分离：人工培养基上不易生长，接种兔睾丸或眼前房内繁殖，并能保持毒力。34-35℃，分裂为30-33小时。

抗体检测：产生特异性抗体、反应素抗体（表面脂质引起），有非密螺和密螺抗原试验。初筛试验和疗效观察---非密螺抗原试验，正常牛心肌心脂质为抗原测患者血清中反应素，判断是否复发及再感染。最常用VDRE、RPR试验。VDRE以胆固醇为载体。玻片凝集可定性和半定量，低倍观察。RPR用未处理活性炭颗粒吸附VDRE抗原。专用纸片圈内（18mm）可定性和半定量。

密螺抗原试验（证实试验）---FTA-ABS作为诊断梅毒“金标准”试验。它是间接荧光抗体检测方法，

75. 肠产毒型（ETEC）：作用小肠，霍乱样肠毒腹泻，是5岁以下婴幼儿和旅游者腹泻的重要病原菌；肠毒素有耐热和不耐热，LT-Ⅰ是引起人类主要的致病物质，对热不稳定，65℃30分钟被破坏，A亚单位是毒素的活动部位。耐热肠毒素（ST）是通过激活肠黏膜细胞上的鸟甘环化酶，使胞内CGMP量增多而导致腹泻。

肠致病型（EPEC）：作用小肠，水样腹泻，是婴儿腹泻主要病原菌。

肠侵袭性型（EIEC）：作用大肠，志贺样腹泻，很像菌痢，发热腹痛脓血便及里急后重。

肠出血型（EHEC）：其中O157：H7可引起出血性腹泻和溶血性尿毒症，是4岁以下儿童急性肾功能衰的主要病原，6、7、8三月最高，北美多见。毒力因子：志贺样毒素、溶血素、LEE毒力岛、Vero毒素。

肠集聚型（EAggEC）：婴儿和旅游者腹泻持续性水样腹泻。

76. 志贺氏菌分：痢疾（A群），福氏（B群），鲍氏（C群）（半透明、光滑型菌落），宋内（D群）（扁平粗糙型菌落）四群，我国以福氏和宋内常见，无荚无芽无鞭，KIA：K/A，产气＋/－，H2S－，MIU－＋/――，最后可用诊断血清作群型鉴定

	群	血清型	葡萄糖	乳糖	甘露醇	鸟氨酸脱羧酶
痢疾志贺菌	A	1-10	+	-	-	-
福氏	B	1-6	+	-	+	-
鲍氏	C	1-18	+	-	+	-
宋内	D	1	+	-	+	+	只有一个血清型，Ⅰ相和Ⅱ相

加热60℃10分钟杀死，有强烈的内毒素，作用于肠黏膜，使其通透性增高。粪-口传播，只局限于肠道，一般不进侵入血，发热、腹痛、水样腹泻，后转为脓血黏液便，伴有里急后重、下腹部疼痛。急性中毒性痢疾多见小儿。粪便不能即时送检，需保存在30%甘油缓冲盐水中。志贺菌表达黏附、穿透上皮细胞、胞内繁殖、及扩散等活性的基因存在于大质粒上。

测志贺菌的侵袭力用Sereny试验，接种于豚鼠眼结膜囊内。

快速诊断：1、免疫染色法2、免疫荧光菌法3、协同凝集试验4、胶乳凝集试验5、分子生物学方法

77. 伤寒与副伤寒菌：无芽无荚有鞭毛（除鸡沙门）多数有菌毛，H2S可阳性，伤寒菌产酸不产气，菌体抗原有58种，鞭毛抗原有两相即特异性和共同，表面抗原有Vi，M，5三种，变异有：S-R，H-O，v-w，相位。

伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌、希氏沙门菌。所致疾病4类型：

（1）、肠热症：第一次菌血症，发热、不适、全身痛，与菌的感染剂量有关，通常潜伏期为2周，第二次菌血症，高热7-10天，缓脉、肝脾肿大，皮肤出现玫瑰疹，外周白细胞明显下降，严重者有出血或肠穿孔等并发症。

（2）、胃肠炎（食物中毒）：由摄入大量＞108被鼠伤寒沙门菌(常引起食物中毒)、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌污染的食物引起。致病机制：细菌释放的内毒素。发热、恶寒、呕吐、腹痛、水样腹泻。

（3）、败血症：4、无症状带菌者：

标本：第1-2周采血，接种于室温＞20℃平衡血培养瓶，不能超过2小时送样，不能即时送样放在室温，切勿放冰箱；第3-4周取粪便；第3周起还可取尿液；整病程均可取骨髓液。

病原分离：血液和骨髓须按1：10加入血液需氧培养瓶或胆盐葡萄糖肉汤增菌后接种于血琼脂平板或营养琼脂平板，SS—双糖或三糖铁（TSI）培养基。粪便接种麦康凯（MaC）/DHL、SS平板上，或SF增菌。

病原鉴定：凡符合克氏双糖铁（KIA）斜面或三糖铁（TSI）：不发酵乳糖、蔗糖，发酵葡萄糖、麦芽糖甘露醇，产气＋/－，H2S＋，吲哚尿素V-P均－，硝酸盐还原阳性，多价血清阳性的为沙门属。尿素酶试验与变形杆菌区别。胞内寄生菌，临床上主要为不明原因持续发热。尿素半固体（MIU）。A-F群沙门菌（O）多价血清作玻片凝集，阳性则选用O2、 O4、 O7、 O9因子定群。

血清学诊断：肥达试验，一般伤寒沙门菌O凝集效价＞1：80、H＞1：160，副伤寒H＞1：160具有诊断意义。新一代疫苗：伤寒Vi荚膜多糖疫苗。

78. 变形杆菌属：普通，奇异，产黏。普罗威登斯属有：产碱，斯氏，雷极，摩根菌只有摩氏摩根菌。有明显多形性，呈球状或丝状，生长于10～43℃，在固体培养基上普通和奇异呈迁徙生长现象，三属氧化酶阴性，苯丙氨酸脱氨酶阳性G-杆菌，加入1%石炭酸或苯乙醇使终浓度为1g/L和0.25%可抑制变形菌迁徒样生长。能迅速分解尿素以区别沙门菌，外斐试验辅助诊断立克次体

79. 耶尔森氏菌（鼠疫）：有7种，鼠疫，假结核，小肠与致病有关。带有3种质粒，主要的致病决定基因由质粒和染色体上的毒力岛编码。

鼠疫耶尔森：有荚无芽无鞭，两极浓染，28～30℃，pH6.9～7.1，液体中培养好，底部可有钟乳石样，常用1%溶血的胰酶消化肉琼脂（赫氏琼脂）加入亚硫酸钠或脱纤维血有刺激生长，用腐败材料分离，培养基中加入甲紫、胆酸钠抑制杂菌，龙胆紫亚硫酸钠为其选择性培养基，3%氯化钠上生长呈多形性。

小肠耶尔森：无动无芽无荚G－，25℃有动力，有周鞭毛，最适温20～28℃，VP试验25℃阳性，37℃阴性，KIA只利用葡萄糖，MIU22℃动力阳性37℃阴性。假结核：25℃有周鞭毛有动力37℃无动力，最适温30℃，pH6～8。血清检测的抗体是F1

经典鼠疫“四步检验”：显微镜检查（美兰染色）、培养、鼠疫噬菌体裂解试验（早期为暗黄的灰色表面粗糙的颗粒样突起，在血培养上有花边状薄而透明不整齐的边缘菌落。48小时为灰白色中央突起菌落，）、动物实验（小鼠、豚鼠）。

快速检测；PCR（高度特异性基因：fra、pla、inu、hms）、免疫检测（F1抗原）

所有疑似鼠疫病人都需采取血标本，疑似腺鼠疫病人取肿大淋巴结穿剌液；肺鼠疫病人取咳痰、咽拭子标本。

80. 枸橼酸杆菌：有弗劳地，异型，无丙二酸盐。只有弗劳地靛基质－，H2S＋，仅异型的丙二酸盐＋，β-半乳糖苷酶，赖氨酸脱羧酶，枸橼酸利用三试验：枸橼酸菌＋－＋，沙门－/＋＋＋，爱德华－＋－。

81.胶体金标记技术应用领域：免疫层析技术。其优点---标记物非常稳定。

82.细菌明胶液化试验原理---某些细菌产生胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸而液化。

氧化酶试验--用于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别。胆汁溶菌试验--用于肺炎链球菌与甲型链球菌鉴别

ONPG试验—迟缓分解乳糖的细菌试验为阳性。

83. 沙雷菌：最适温10～36℃，4%氯化钠下可长，产生灵红霉素（非水溶）和吡羧酸（水溶），关键生化是DNA＋和葡萄糖酸盐＋。

85. 霍乱菌：呈弧状或逗点状，米泔样粪便作悬滴观察，细菌呈穿梭样或流星状运动；粪便涂片镜检见排列如“鱼群”状G－菌，耐碱不耐酸，可繁殖pH6.0-9.2。最适宜生长pH7.2-7.4。血清分型可分为AB的小川型，AC的稻叶型，ABC的彦岛型

病原分离：水样便直接接种在硫代硫酸盐－柠檬酸盐－胆盐－蔗糖平板（TCBS）上37℃形成较大黄菌落，在含亚碲酸钾或庆大霉素平板选择性平板上呈灰褐色。食品及水样常用碱性蛋白胨水增菌培养后再接种，钠离子可剌激生长，但在＞8%NaACI中不生长。常用的保存或运送及增菌用碱性蛋白胨水，文-腊二氏，卡-布。

病原鉴定： O1群无芽胞，无荚膜，单一鞭毛；O139群菌体周围有一层比较薄的荚膜。测定耐热的特异性O抗原，用玻片凝集或ELISA鉴定，血清效价1：40-1：50。不耐热的非特异性H抗原，有两个环状染色体，即染色体1、染色体2。

深入鉴定：流行株与非流行株依靠噬菌体---生物分型法。噬菌体（VP1-VP5）将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型。根据溶原性、溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验、溶血试验，将埃尔托型霍乱弧菌分成a-l共12个生物型。常见的流行株为噬菌体1-3型，生物型a-d型，常见的有：la、lb、ld。产毒基因鉴定：用PCR检测ct基因，流行株常带有霍乱肠毒素。

免疫检测：霍乱为肠为非侵袭性细菌，主要剌激局部黏膜产生分泌性AgA抗体，同时大量毒素及细菌脂多糖体的产生使机体产生抗毒和抗菌抗体。

恢复期带菌者是指临床症状消失后3个月内带菌者，恢复期带菌的时间一般不超过 2 周，健康带菌者的排菌时间一般不超过7天。

86. 副溶血弧菌：嗜盐性弧菌（与霍乱显著区别），是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌，两极浓染，NaCl最适35g/L，无盐不长，pH7.0～9.5，最适pH 7.7，不耐热，不耐酸，在TCBS上不发酵蔗糖菌落绿色，＞80g/L盐内不长，神奈川现象（β溶血），KP+是致病株能使人或兔红细胞发生溶血对马红细胞不溶血为阳性。

87. 气单胞菌最适生长温度30℃，但在0～45℃皆可生长。

88. 弯曲菌属是一类微需氧菌，不分解糖，氧化酶+，菌体弯曲逞豆点状，S状或螺旋状有动力G－菌，5种5亚种，对人致病的主要是空肠弯曲菌（人类腹泻最常见之一，43℃生长，25℃不生长）

89. 幽门螺杆菌（HP）：常用布氏培养基或脑心浸液血琼脂加入5～10%羊血和马血，在（85%N、10%CO2、5%O2）条件下，37℃3—7天，长成针尖状的半透明菌落，加入万古霉素、TMP、两性霉素B等组成抑菌剂防止杂菌生长。与十二脂肠溃疡、胃癌、胃淋巴瘤发病有关。传染源主要是人，粪-口途径。标本：胃黏膜活检组织；

病原鉴定：生物特性是具有大量高活性的尿素酶，迅速分解尿素，氧化酶＋、触酶＋，具有碱性磷酸酶、r-谷氨酰转肽酶活性，硝酸盐还原＋，可生长于5%甘氨酸、0.04%氯化三苯四氮唑培养基中，三糖铁中不产生硫化氢，微需氧5～8%，37℃生长，25℃和42℃均不生长的G－菌，初次分离要3～4天。

快速检测：尿素呼吸试验---简单快捷，可以特异地诊断HP现症感染，敏感性高。主要采用13C、14C（放射性同位素）标记尿素，13C用于儿童和孕妇。

90.《伯杰系统细菌学分类》的标准：G染特性，形态，鞭毛，芽胞，荚膜，代谢产物。

91. 有芽胞的厌氧菌：只有梭菌属包括83个种。厌氧菌每克粪中高达1012个，标本绝不能被正常菌污染，应尽量避免接触空气。最理想的标本是组织，送到实验室后20～30min内处理完不超过2h。应接种固体和液体两种培养基，应使用预还原培养基，液体培养基应煮沸10min以驱氧并立即冷却。每份标本至少接种三个血平板，置于有氧，无氧，5%～10%CO2环境中培养。厌氧手套箱培养法是迄今最佳厌氧培养仪器之一。

92. 厌氧状态的指示剂有：美蓝和刃天青，无氧时白色，有氧时美蓝蓝色，刃天青粉红色。紫外线下出现荧光也是厌氧菌参考之一，卡那霉素用于梭杆菌与类杆菌的区分，甲硝唑用于厌氧菌和非厌氧菌的区别。气液相色谱已成为鉴定厌氧菌及其分类比较可靠的方法。

93. 破伤风杆菌：鼓槌状，早期培养G＋，48h后特别是芽胞形成后G－，的O和H抗原，主要症状为骨骼肌痉挛，不发酵糖类，能液化明胶产H2S。产生两种外毒素：破伤风溶血素、破伤风痉挛毒素

94. 产气荚膜梭菌：G＋，20～50℃均能生长，最适为45℃，双层溶血，可分解糖类产酸产气，出现汹涌发酵现象，分5型，主要是A型，外毒素以A毒素为主，本质是卵磷脂酶（α毒素），在蛋黄琼脂平板上菌落周围出现乳白色浑浊圈。所致疾病为气性坏疽，有捻发感，青霉素为首选，万古为次选。

95. 肉毒梭菌：G+，芽胞胶囊于次极端呈汤匙状或网球拍状，严格厌氧，8型，以A，B多见，毒素不耐热，1min煮沸即死。

96. 无芽胞厌氧菌是一大类正常菌群，引起感染是内源性感染。

97. 白喉棒状杆菌：为放线菌，G+，无荚无芽无鞭无毛，奈瑟（Neisser）染色成黄褐色，一端或两端染成蓝色或深蓝色颗粒即异染颗粒，阿培特（Albert）染色菌体呈蓝绿色，异染颗粒成蓝黑色。

分离培养：棉拭子取咽喉部、鼻腔、皮肤病变部位，血平板，吕氏血清斜面（生长迅速，乳白色，S型，形态典型），哥伦比亚血培养基及亚碲酸钾血琼脂（48小时以上，菌落黑色，筛选鉴别）。白喉毒素是一种毒性强、抗原性强的蛋白质，B-棒状杆菌噬菌体毒素基因（tox+）编码的蛋白质，PCR扩增tox+基因辅助诊断不能确诊。免疫沉淀试验（EleK平板试验）检测产生白喉外毒素，是诊断白喉的关键试验。细菌一般不侵入血，但外毒素可入血引起毒血症，不能立即送检时应浸于无菌生理盐水或15%甘油盐水中。出现各种心肌炎，软腭麻痹是白喉晚期死亡的主要原因。（白喉类毒素、百日咳菌苗、破伤风类毒素的混合疫苗DPT）

98. 百日咳鲍特菌：专性需氧，常用包-姜培养基（含青霉素G）细小S银灰色不透明珍珠状菌落，在加血培养基上,周围有狨毛状狭窄溶血环，液体培养基中混浊生长。菌落常S-R相变异，Ⅰ相S型，Ⅱ、Ⅲ相过渡型，Ⅳ相R型。有百日咳毒素，丝状血细胞凝聚素和腺嘌呤环化毒素。细菌不进入血流。临床分为3个期：1、卡他期2、痉咳期3、恢复期。依据菌落性状及凝集试验确诊。抗原有PT、FHA，主要用ELISA方法。可获持久免疫力

咳碟法：包-姜培养基（含青霉素G）置10cm使飞沫直射于培养基上，37℃2-3天

鼻咽拭子法：如不能及时接种可放入0.3毫升PH7.2—7.4的1%蛋白胨生理盐水中2小时内检

99. TBE-Tris硼酸缓冲液，长时间电泳选用。MIC-最小抑菌浓度

101．决定细菌的形态因素：培养基的成份、PH、培养时间、温度。直接观察细菌的超微结构：超薄切片技术、电子显微镜。

102. 芽胞：在80℃水中迅速死亡，在100℃水中能耐受2小时以上，在70%乙醇中能存活20年。高压蒸气灭菌杀死细菌牙芽胞最有效。荚膜的重要功能：抗吞噬。是构成细菌毒力的因素之一。

卫生毒理学

1．外源化学物在体内的生物转运：吸收、分布、代谢、排泄四阶段。

化学毒物在体内的代谢分为两相：Ⅰ反应---氧化、还原、水解；Ⅱ反应---与体内源性物质结合

亚慢性毒性试验目的：最大无作用剂量、最大耐受剂量估测阈剂量。（选用两种种属及啮齿类、非啮齿类，初断乳动物）

慢性毒性试验目的：最小有作用剂量、阈剂量、最大未观察到有害作用剂量（选用两种种属及啮齿类、非啮齿类，初断乳动物）

危害性评价组成：认定、描述、接触评定、特征分析

毒理学试验项目：第一阶段：急性毒性试验。第二阶段：遗传毒性试验。第三阶段：亚慢性毒性试验。第四阶段：慢性毒性试验和致癌试验

GB 19489—2004《实验室生物安全通用要求》分级：危害等级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

生物安全防护水平（BSL-1、2、3、4）。

生物安全柜一级：可保护工作人员和环境。生物安全柜二级：分A1、A2、B1、B2可保护工作人员、环境、样品。生物安全柜三级：

2．普通光学显微镜：最高分辨率0.2um,不能观察细菌的亚结构

3．暗视野显微镜：分辨率0.02-0.04um,载玻片厚度1.0mm、盖玻片0.17 mm

4．荧光显微镜：

5．滴定管精度为0.2—0.1ml,微量滴定管精度为0.005ml。微量吸管5—1000ul。培养皿分：5、7.5、9、10cm

蛋白质、核酸提取及相关设备

一、蛋白质分离纯化----实验室常用盐析法（硫酸铵）。

核酸纯化----酚、氯仿抽提

制备细胞外膜蛋白----超声波细胞粉碎机。

大多数限制内切酶使用温度37℃，保存温度是-20℃。

二、层析

凝胶过滤法（分子筛层析法）---主要用于蛋白或核酸分离。介质：葡聚糖。过滤中先洗脱的是大分子物质，后小分子物质。原理：纤维素或凝胶介质带电荷不同。

三、检测仪

1、分光光度计及检测物质

	分光光度计	波长nm	比色皿
检测细菌浓度	可见分光光度计	600	玻璃
测定颜色	可见分光光度计	450
检测蛋白	紫外分光光度计	280	石英
检测核酸	紫外分光光度计	260	石英

2、紫外透射仪：暗室紫外线下看DNA条带。

3、测序仪：蛋白测序仪---测定氨基酸排列顺序

DNA测序仪---测核苷酸排列顺序。物质是；质粒、噬菌体、PCR产物

4、扩增仪：能做PCR称DNA扩增数

5、酶标仪：

二、电泳类：	用于	原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）	蛋白质、核酸分离	用垂直电泳槽，凝胶介质形成立体多孔网状结构，过硫酸铵起催化聚合作用, Tris-甘氨酸缓冲液。分离DNA片段最佳范围5-500bp
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）	蛋白分离	聚丙烯酰胺浓度越大，线性分离范围越小。十二烷基硫酸钠作用是解离蛋白，常用蛋白染料--考马斯亮蓝，甘氨酸—缓冲
琼脂免疫电泳	蛋白分离和鉴定
脉冲电场凝胶电泳（PFGE）	核酸分离	用琼脂糖作介质。为正交的交变脉冲电场；条带靠近负极为大片段DNA，靠近正极为小片段DNA。DNA染色用溴化乙锭（EB）或硝酸银。（分析大分子物质）
琼脂糖凝胶电泳	核酸分离与纯化	1%琼脂糖作支持介质，有“分子筛”和“电泳”的双重作用。用水平电泳槽，充分分离DNA片段最佳范围200bp-50kb
等电聚焦电泳（IFE）	蛋白质分离	以两性电解质制造凝胶有不同PH，使带不同电荷的多肽在电泳条件下于等电点停留。用聚丙烯酰胺制备等电聚焦电泳凝胶。浓缩效应、分辨率高、重复性好、用时少
对流免疫电泳（CIE）	测定抗体或抗原	缓冲液是PH8.6巴比妥液，使抗原抗体均带负电，抗原向正泳，抗体电渗作用向负泳。
火箭电泳	测抗原量
交叉定量免疫电泳	测抗原量
醋酸纤维膜电泳	免疫球蛋白鉴定
变性聚丙烯酰胺凝胶	单链（DNA或RNA）片段分离与纯化

四、快速斑点免疫金渗滤法（滴金免疫法）：属于常用的胶体金技术。方法是---以硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将试剂和标本滴加在膜上，通过渗滤而逐步反应，全程可于数分钟内完成，阳性在膜上呈红色斑点。基本原理是间接法或夹心法

免疫胶体金技术用于检测：抗原、半抗原、抗体

ATCC是指美国典型培养物保藏中心。

MPS---单核-吞噬细胞系统，又称巨噬细胞系统。

玻片凝集反应---2-3分钟看结果；试管凝集反应---18—24小时看结果；沉淀反应---72小时看结果；补体结合试验（CFT）---30分钟看结果

过滤式微生物采样器根据过滤材料不同有：薄膜过滤器、玻璃纤维过滤器、凝胶过滤器、谷氨酸碱过滤器。

病毒的分子生物学鉴定：病毒核酸和蛋白质测定。蛋白质使用--免疫测定技术、电泳技术、质谱技术；核酸使用—探针技术、杂交技术、聚合酶链反应技术

构建基因组文库，初始DNA长度须在90kb以上。纯化的mRNA在70%的乙醇中可保存1年以上。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4或6个核苷酸。

为获得条带清晰的DNA电流图谱DNA用量为0.5—1.0ug.

在酶切图谱制作过程中,分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法---聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳。

普通水平电泳制备染色体DNA酶切图谱时，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系，分离＜0.5kb DNA片段所需胶浓度是1.2%-1.5%，分离＞10kb DNA片段所需胶浓度是0.3%-0.7%，在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所加电压成正比，电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使＞2kb DNA片段的分辩率达到最大，所加电压不得超过5V/cm。

细菌的培养技术

一、培养基：1、营养物质：蛋白胨、肉浸汁和牛肉膏、糖醇类、血液、动物血清与鸡蛋、无机盐类、生长因子。

二、水分。

三、凝固物：琼脂、明胶、卵蛋白及血清

琼脂：成份为多糖，赋形物。固培养基2—3%，半固培养基0.2—0.5%

明胶:主含蛋白质,24℃以上溶解,20℃以下凝固

四、抑制剂：五、指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、甲基红、溴香草酚蓝、中国蓝、酸性复红等酸碱指示剂；美蓝氧化还原指示剂。

一般培养基高压121℃，1.05㎏30分钟。含糖培养基高压灭菌0.56㎏15分钟。

培养螺旋体常用培养基---Korthof，温度28℃，含有10%兔血清。

MPN法---稀释培养测数法。适宜测定土壤中微生物中的特定生理群。

活菌计数最准确的方法---倾注平板计数法。最快的细菌计数方法---显微镜直接计数法。

空斑形成数---PFU

我国最早实验室生物安全卫生行业标准是：微生物实验室生物安全通用守则。2003年8月1日实行。

我国第一部实验室生物安全国家标准是：《实验室生物安全通用要求》。2004年10月1日执行。

WHO制定的生物安全指南：《实验室生物安全手册》2004年11月出版第3版。

细菌的生化反应试验

糖醇类代谢试验：糖发酵试验、甲基红试验、V-P试验、葡萄糖氧化/发酵试验（O/F试验）、七叶苷水解试验、B-半乳糖苷渗透酶试验。

糖发酵试验原理：多糖→单糖→丙酮酸→酸性产物（或产酸产气）→PH下降→指示剂呈酸性变色。

蛋白质类代谢试验：靛基质试验、硫化氢试验、苯丙氨脱氨试验、尿素酶试验

双糖：葡萄糖、乳糖；三糖：葡萄糖、乳糖、蔗糖；

双糖高层斜面发酵管：葡萄糖/乳糖=1：10

三糖铁与双糖铁区别：蔗糖。糖类发酵是鉴定细菌最常用的生化反应。需氧芽胞菌除炭疽外均有鞭毛。

TI-Ag的特点: 非胸腺依靠性抗原,不需T细胞辅助即可刺激机体产生抗体。少数Ag属此类。如细菌多糖、聚合鞭毛蛋白等。共同特点：TI-Ag刺激机体产生的Ab仅是免疫球蛋白M，不引起回忆应答，不引起细胞免疫。

鉴定肠杆菌科基本条件；发酵葡萄糖、氧化酶阴性、还原硝酸盐。
核酸检验基本技术
转录----在生物体内，DNA指导的RNA合成过程。合成RNA时DNA双链要解旋，解旋部位称为启动子。大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其o亚基有启动子作用。

反转录病毒基因组一般不具感染性。

2．变态反应（超敏反应）------是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，发生的一种以机体生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的特异性免疫应答。

在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。DNA在合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3’末端的羟基上。在合成发生错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，于此处加上正确的核苷酸。与人工合成DNA区别。

大肠杆菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶---DNA聚合酶Ⅰ。复制最主要的DNA聚合酶---DNA聚合酶Ⅲ，该酶的核心聚合酶中，具有3’--5’外切酶活性的亚基是e亚基。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段没有5’--3’外切酶活性。逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。在体内DNA复制必须有RNA引物。

合成中tRNA搬运氨基酸作用、rRNA构成核糖体骨架、mRNA直接决定蛋白质结构。

Ⅰ型变态反应：即速发型，又称过敏反应。特点：过敏原进入机体后，诱导B细胞产生IgE抗体。由IgE介导，肥大细胞和嗜碱粒细胞等效应细胞以释放生物活性介质的方式参与反应；发生快，消退亦快；

Ⅱ型变态反应：细胞毒型/细胞溶解型，抗体（多属IgG、少数为IgM、IgA）首先同细胞本身抗原成分或吸附于膜表面成分相结合，然后通过四种不同的途径杀伤靶细胞

Ⅲ型变态反应：即免疫复合物型，又称血管炎型超敏反应。特点：游离抗原与相应抗体结合形成免疫复合物（IC），若IC不能被及时清除，即可在局部沉积，通过激活补体，并在血小板、中性粒细胞及其他细胞参与下，引发一系列连锁反应而致组织损伤。

Ⅳ型变态反应：即迟发型（细胞介导型），Ⅳ型是由特异性致敏效应T细胞释放的LF介导的。

分泌型IgA（S IgA）分布于呼吸道、消化道、泌尿生殖道黏膜表面。是机体黏膜防御感染的重要因素。

免疫原性含义：剌激机体免疫系统，有诱生抗体和致敏淋巴细胞的能力。产生抗体的细胞是B细胞，本质是免疫球蛋白（Ig）。免疫球蛋白（Ig）的分类主要依据—重链恒定部份CH的结构特点。

T细胞是：细胞毒性T细胞。浆细胞来源于活化B细胞。特异性B细胞经过抗原识别、活化、增殖、分化成为浆细胞。

可以保持蛋白质活性的蛋白质沉淀方法是：硫酸铵、聚乙二醇、免疫沉淀法。

可用于检测致泻大肠埃希菌肠毒素的方法：酶联免疫吸附试验检测LT和ST、双向琼脂扩散试验检测LT、乳鼠灌胃试验检测ST.

琼脂糖凝胶电泳缓冲液通常用：1*TAE或0.5*TBE，溴化乙锭是诱变剂。

鉴别宋内志贺菌与其他志贺菌的生化反应是：鸟氨酸试验。

卡介苗简称为：BCG

钩瑞螺旋体可以引起肺部感染

Vero细胞毒素是O157：H7大肠杆菌的最主要致病物质

耐热直接溶血素属于副溶血弧菌的主要致病物质

Ag与Ab结合的部位是：VH+VL

Ag决定基是: 决定Ag特异性最小化学基团

HIV造成免疫系统的多种功能发生缺陷的主要原因是: T4淋巴细胞耗竭

EBV除引起人类皮肤和黏膜的疱疹样病变外，还与下列人类鼻咽癌疾病密切相关

核衣壳是病毒粒子的主要结构，核衣壳是由衣壳和核酸成分组成的

做补体结合试验前血清加热灭活以破坏它所含有的补体，通常羊血清用58℃温度灭活

我国于1981年开始用地鼠肾细胞疫苗，近几年又开始应用更为先进的狂犬病疫苗，这种疫苗是: Vero细胞狂犬病疫苗

当进行抗球蛋白试验查不完Ab时，其中一个重要试剂是第二Ab，在抗球蛋白试验中第二抗体是----双价抗体

在CFT反应中有5种成份：Ag、被检血清、补体、溶血素和SRBC，CFT反应中补体的作用是: 非特异性结合。在CFT反应中为了查Ag，常常降低反应温度，称为冷CFT，冷CFT反应温度通常是：4℃

目前已知的可以在临床上造成出血热的病毒如下：

布尼亚病毒科：流行性血热、克里米亚刚果出血热

黄病毒科：登革出血热

丝状病毒科：艾博拉出血热。病毒在胞浆内繁殖，芽生释放。急性期标本接种于Vero细胞培养或藤鼠腹腔

与小儿顽固性腹泻有关的是：肠集聚粘附性大肠埃希氏菌

引起旅游者腹泻的最主要的是：肠产毒性大肠埃希氏菌

钩体病的主要传染源是：鼠类动物。发病一周内取血液，第二周以后取尿，有脑膜炎型症状者取脑脊液进行检查。

病毒检验基本技术

1．组织培养用玻璃器皿：硫酸、重铬酸钾液浸泡。

2．人工综合组织培养营养液：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助生长因子。MEM、RPMI 1640

3．细胞培养液分生长液、维持液，两者区别在血清含量不同。EDTA、胰蛋白酶分散作用。

4．细胞病变（CPE）、二甲亚砜（DMSO）细胞保护剂、

5．半数致死量（LD50）--导致半数动物死亡的细菌感染量。是评价化学毒物急性毒性大小最重要的参数。（大小鼠、雌雄各半，初成年，受试后14天内总死亡数）

最小全数致死量（MLD）--引起全部动物死亡的最小感染剂量。半数感染量（ID50）--导致半数组织培养细胞发生感染的细菌数量或毒素剂量。TCID50—半数细胞培养物感染量。

一、致死剂量LD: (1)绝对致死剂量LD100 (2)最小致死剂量LD01 (3)最大耐受剂量LD0

二、效应、反应、剂量—效应、剂量—反应、关系曲线

6．超过滤法：用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液。

7．中和抗体抗病毒机制：改变病毒表面的构型，阻止病毒吸咐、穿入易感细胞进行繁殖。

8．迟发感染的特点：又称慢发病毒感染。潜伏期很长可达数月、数年或数十年之久。一旦症状出现，多为亚急性、进行性，并造成死亡。

包涵体----病毒在增殖过程中使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见，多为圆形、卵圆形或不定形。

9．引起脑膜炎的肠道病毒：肠道病毒70型、肠道病毒71型、柯萨奇A组16型、脊髓灰质炎病毒。

10. C6/36是白蚊伊蚊细胞：分离登革热、乙脑病毒。

11. 蓄积系数经值：＜1高度、1—3明显、3—5中度、＞5轻度。

12. 协同作用---一种物质的存在能促进其他物质效应的作用。

13. 病毒病的常规实验室诊断指----病毒的分离和鉴定、形态学检查、免疫学鉴定、分子生物学鉴定。

14. 空斑试验---用于测定病毒的感染力。

15. Versen----又称EDTA

16. 病毒的形态学检查方法---电子显微镜（EM）、光学显微镜、超速离心法、超过滤法、X射线晶体衍射法。

17. Alsever液---是一种红细胞保存液，含有抗凝剂柠檬酸钠和细胞需要的养分葡萄糖。pH值调到6.1，经过69千帕，15分钟的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。

18. 常用的细胞培养液：MEM、1640。加入HEPES具有较强的缓冲能力。

19. 中和试验----必须制备高效价免疫血清或取高滴度病人恢复期血清。

20. 原位杂交----可直接检测或定位细胞内毒基因。

21. 乙脑病毒主要存在于血清中，用一于分离病的血清一般不加抗凝剂。

22. 麻疹病毒主要吸附在白细胞上，加抗凝剂可提高分离率。

23. 鼻咽拭子的除菌处理：加抗生素终浓度20 000U/ml，4℃作用4小时，2000转/ min，离心20分钟。

24. 大便标本的除菌处理：加抗生素终浓度10 000U/ml，4℃过夜或1000转/ min，离心20分钟。

将含病毒的悬液2000--6000转/ min，离心30--40分钟，可除去90%以上的细胞碎片和杂质。

25. 流式细胞术: (1)一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。

(2)一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。

(3) 用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

26. 病毒RNA的碱基序列与mRNA完全相同，称为正链RNA病毒，这种病毒RNA可直接起病毒mRNA的作用。病毒RNA碱基序列与mRNA互补者，称为负链RNA病毒，负链RNA病毒的颗粒中含有依赖RNA的RNA多聚酶，可催化合志互补链。

27. 蜡样杆菌能耐受100℃30min。

检验技术资格考试考点精要——微生物学检验（中级下）

101. 炭疽杆菌：最大的致病G＋杆菌，菌落灰白色，表面干燥呈“毛玻璃”状，稍隆起，低倍镜下菌落边缘呈明显卷发状如（狮鬃），人工培养呈竹节状长链，不分解乳糖，对碘和氧化剂敏感，有菌体多糖，荚膜多肽，芽胞，炭疽毒素四抗菌素原，质粒编码：毒力因子毒素、荚膜。毒素基因位于大质粒pXO1上，荚膜基因位于小质粒pXO2上，二者是致病必须的。各型均应采血液标本。镜检：革兰、荚膜染色。毒力鉴定：1、质粒电泳图谱分析 2、PCR扩增

其选择培养基是戊烷脒血平板，鉴定试验有：青霉素敏感试验、串珠试验，噬菌体裂解试验（AP631株），重碳酸盐毒力试验（有毒力形成芽胞呈M型）。用1:1000的升汞固定5min。

102. 产单核李斯特菌：有鞭毛，无牙胞对人致病，在羊血平板上β溶血环，25℃有动力，37℃动力缓慢（此特征可作为初步判定），能在4℃进行冷增菌，在半固体中可现倒伞状，致病物质为李斯特菌溶素O，通过胎盘或产道感染新生儿是重要特点，常伴EB病毒引起传单。

103. 结核分枝杆菌：人型和牛型，专性需氧，曾发现G＋非抗酸颗粒称Much颗粒，无芽无鞭无荚，烛缸法不适，应用二氧化碳培养皿，常用罗－琴或米氏7H10培养基，35～40℃可长，35～37最适，pH6.5～6.8，18h分裂一代，2～6周才能长出菌落，不发酵糖类，人型的烟酸，硝酸盐还原，烟酰胺酶试验均阳性。可出现Koch现象（初次不发生速发型过敏反应），是Koch在1891年观察到。结核菌素试验红肿硬结：50IU/ml制剂，≤5㎜阴性，≥5㎜阳性；≥15㎜强阳性。结核菌素----旧结核菌素（OT）与结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）的通称。

结核病的诊断依据：临床表现、X线检查特征的肺结核表现、结核菌的痰涂片检查、以及结核菌素试验为主要手段的免疫测试。依赖细胞免疫，迟发超敏反应伴随细胞免疫存在而存在。

结核病动物接种的鉴别诊断所接种的敏感动物---豚鼠，腹股沟皮下。每油镜视野1—9条抗酸菌3+

结核分枝杆菌，无内外毒素，致病性与其索状因子，蜡质D，分枝菌酸有关。蜡质D为细胞壁主要成份，是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能引起迟发性过敏反应，并具有佐剂作用。

104. 麻风病原： Hamsen在1937年发现麻风分枝杆菌。具有多形性、抗酸性、聚集性，典型胞内菌。G＋，无动力无芽无荚，人是唯一的宿主和传染源，分瘤型和结核型。免疫功能决定了感染后是否发病及临床类型。麻风菌的有效保护性免疫取决于细胞介导的免疫，没有体液免疫缺陷。主要用涂片染色显微镜检查，鼻黏膜或皮损处取材，用抗酸性染色后检查。除临床检查外，皮肤切刮法涂片查菌及组织病理学检查可有助于麻风诊断的确定。一般瘤型和界线类患者标本中可找到细菌在细胞内存在，有诊断意义。结核样型患者中很少找到细菌。

105.空肠弯曲菌：菌体轻度弯曲似逗点状，菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2的环境中生长最好。最适温度为37～42℃。内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，致病因素：粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制（并发症一格林一巴利综合征），产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病

临床：腹痛、腹泻、发热，多见散发，是夏秋季腹泻和旅行者腹泻的主要病因之一。主要是污染水、食物。标本采0—5日内用药前，于运送培养基中4小时内检。

分离培养：采样棉拭子涂于万古霉素、多粘菌素的肉汤增菌培养，再接种于哥伦比亚血(5%脱纤维绵羊血)平板上,42℃培养微需氧（85%N、10%CO2、5%O2）2-3天，不溶血、灰色扁平、湿润光泽、像水滴，边缘完整发亮。

病原鉴定：氧化酶、过氧化酶阳性，G—呈S型、螺旋状、纺锤形可初步确定为弯曲菌。再做42℃、25℃生长试验（布氏杆菌肉汤），H2S试验阳性（排除胎儿弯曲菌）、马尿酸盐水试验阳性（排除结肠弯曲菌）。多引物一步PCR扩增法----空肠弯曲菌mapA基因特异彩片段等。

106.铜绿假单胞菌：条件致病菌，需氧，G－杆菌，有鞭毛，20～42℃长，最适产毒温度是26℃，是35℃，4℃不长，液面可形成菌膜，色素有：绿脓素（溶于水和氯仿），氧化酶阳性，液化明胶、还原硝酸盐，在42℃条件下能生长。荧光素是绿色荧光素（溶于水不溶于氯化）。O抗原有两种：1、内毒素脂多糖2、原内毒素蛋白OEP（类属抗原），选择培养基：NAC（乙酰氨基半乳糖）。

107. 流感嗜血杆菌：寄生人体鼻咽部，抵抗力弱，婴幼儿易感，G—球杆菌，用石碳酸复或美蓝单染呈现两端浓染。要新鲜血液（含Ⅹ和Ⅴ因子）培养基，不溶血，可生长在接种于血平板上的金黄色葡萄球菌的周围，流感嗜血杆菌菌落较大，越远越小，即卫星现象。在含1%蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露并加有Ⅹ和Ⅴ因子的酚红肉汤培养基中进行发酵试验，是鉴别所有嗜血杆菌菌株的方法。

荚膜是本菌的主要毒力因子，根据荚膜多糖抗原分为a-f 6个血清型，b型致病力最强；依据吲哚试验、脲素反应、鸟氨酸代谢分为：8个生物型，大部分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中以Ⅰ、Ⅲ型为主，血清型b型生物型为Ⅰ型。副流感嗜血杆菌生长只要Ⅴ因子。接种于巧克力色、含脑心浸液的血琼脂平板。病原鉴定方法：标本：脑脊液、血液、胸水。

108. 军团菌：1976年，USA费城，G—为胞内寄生菌。无芽胞、无荚膜、有鞭毛，需氧菌（5%CO2剌激生长）常规不易着色，最适为36℃，初次分离要L-半胱氨酸，含铁盐可促进生长，主要可用活性碳－酵母浸出液平板（BCYE），不分解糖。水解马尿酸是嗜肺军团菌特征。活性炭酵母浸出液琼脂（含焦磷酸铁、L-半胱氨酸），菌落呈灰白色，如加溴甲酚紫，菌落呈浅绿色。有杂菌用选择培养基（GVPC），是在BCYE中加入甘氨酸、多粘菌素B、万古霉素及放线酮。试管凝集法抗体的阳性标准：1≥320

水是人类感染的主要来源，水样1L，样本采集到浓缩培养最长不超过14天，最好不超过2天。血液、痰、尿6-8℃避光、隔热运送。并取3份，一份酸处理，一份热处理50℃水30分钟。

证实试验：免疫荧光方法。

感染临床主要有2种形式：1、军团菌病LD（肺炎型）2、庞提阿克热PF

109. 克雷伯杆菌：又称肺炎杆菌，以肺炎克雷伯菌多见，G—有较厚荚膜，多数有菌毛，无芽孢和鞭毛，菌体呈卵圆形或球杆状成双排列，有时菌落出现黏液型用接种环可成丝。具有O抗原和K抗原。是人呼吸道及肠道定殖菌，条件致病菌。主要采痰液，用无菌盐水洗3次+等量PH7.6 1%胰酶37度水中90分钟使痰液均质化，

该菌产生胞外毒性复合物(ETC)，主要成分为荚膜多糖（63%）、脂多糖（30%）和少量蛋白质（7%）。有些菌株还可产生LT和ST肠毒素。荚膜也与致病力有关。动力和鸟氨酸脱羧酶阴性是本菌最大特点。

血琼脂培养基、麦康凯，菌落大呈黏液型，光亮黏稠，菌落易融合，发酵乳糖，呈现有色菌落。利用荚膜肿胀试验分型，3型和12型，magA基因作该菌诊断。rmpA基因作该菌辅助诊断。

三亚种区别：IMViC试验：肺炎亚种――＋＋，臭鼻亚种－＋－d，鼻硬结亚种－＋――。

110. 衣原体：严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物，非运动性的细菌，多少呈球形、堆状，G-，一般寄生在动物细胞内。有独特发育周期，能通过细菌滤器。沙眼，鹦鹉热嗜衣原体，肺炎嗜衣原体。专性细胞内寄生。6-8日龄鸡胚卵黄囊中繁殖，有包涵体。衣原体的两种形态：原生小体（EB，小而致密的颗粒结构，具感染性，姬染紫红色，无繁殖力）。始体（网状体）（RB，大而疏松的结构，衣原体发育中的繁殖体，不具感染性，具增殖力色，丝状分裂增，姬染兰殖），产生类似于G-杆内毒素。培养物中抑制剂----二乙氨基葡聚糖。

111. 立克次体：以节肢动物为传播媒介，严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。人畜共患，立克次体的致病物质主要有内毒素（脂多糖）和磷脂酶 A。免疫是以细胞免疫为主，体液免疫为辅。

培养特性：动物接种是最常用的培养方法 ,采用豚鼠、小鼠可对多种病原性立克次体进行繁殖。鸡胚卵黄囊常用于立克次体的传代。目前常用的细胞培养系统有鸡胚成纤维细胞、L929细胞、Vero细胞,用PCR方法进行鉴定。WHO推荐金标方法----间接免疫荧光方法（IFA）

孵育最适温度为37℃。常用姬姆尼次、姬姆萨染色，多形性，无芽无鞭。标本保存—80或-160℃。雄性豚鼠腹腔接种，39.5以上为特异发热,观察阴囊红肿（流—，地+）

抗原结构：一、可溶性群特异性抗原，与细胞壁表层的脂多糖构成，耐热。另一种为种特异性抗原，与外膜蛋白构成，不耐热。但恙虫病立克次体的细胞壁结构和抗原成分不同，无粘液层、无微荚膜、无肽聚糖和脂多糖，故另立为东方体属。

斑疹伤寒、恙虫病立克次体的脂多糖与普通变形杆菌某些菌株（如OX 19、X2 、OX k 等）的菌体抗原有共同的抗原成分。交叉凝集试验称外斐反应（Weil-Felix reaction），用于立克次体病的辅助诊断。补体结合试验是立克次体最常用的方法。

（一）普氏立克次体 (P.prowazekii) ：是流行性斑疹伤寒的病原体。病人是唯一的传染源，体虱传播媒介，在人与人之间传播

（二）莫氏立克次体(R.typhi) ：又名斑疹伤寒立克次体，是地方性斑疹伤寒的病原体。鼠、蚤传播媒介，又称鼠型斑疹伤寒。

（三）恙虫病立克次体 (R.tsutsugamushi) ：恙虫病立克次体是恙虫病的病原体。啮齿类动物、兔类、鸟类为传染源。人类通过恙螨幼虫叮咬而感染

112. 支原体：无细胞壁，仅有细胞膜（外，中，内，中间是磷脂，内外是蛋白质及糖）呈高度多形性，能通过滤菌器，最小原核细胞微生物。采样黏膜组织，初次培养最适pH7.6～8.0，在95%N2，5%CO2中生长好，菌落呈“油煎蛋”）样菌落，取样：黏膜组织。分离培养是确诊支原体感染的可靠方法之一，接种平板后用胶纸封保湿，培养基中加入胆固醇、血清蛋白和酵母浸液，加酚红，醋酸铊及抗生素抑菌。Giemsa染色呈淡紫色，Dienes染色呈蓝色不易褪色。40倍镜下可见油滴状菌落，100倍下可见桑椹状菌落。

16种支原体中，肺炎、解脲、人型、生殖器、发酵支原体对人致病，肺炎支原体引起间质性肺炎，其它4种引起泌尿生殖道感染。

快速检测：双抗体夹心ELISA法---检测外膜蛋白、免疫印迹技术---检测抗原

114. 肝炎病毒：甲型（HAV）、乙型（HBV）、丙型（HCV）、丁型（HDV）、戊型（HEV）。

甲型（HAV）：正链小RNA病毒科，球形正十二面体，病毒颗粒无包膜，基因组长约7.5kb的正链RNA，核酸RNA有感染性。是在各种条件下抵抗外界变化能力最强的病毒之一。1：4000甲醛液（福尔马林）37度71小时可灭活。粪—口传播。

乙型（HBV）：反转录病毒，嗜肝DNA病毒科，病毒颗粒3种：22nm小球形外膜颗粒、40—100nm 22nm管形颗粒、完整42nmDane颗粒。前两者空心包膜，表面抗原（HBsAg）组成，不含核酸，没感染性。Dane颗粒呈双层外壳圆形颗粒，携带核心抗原（HBcsAg）,抵抗力很强，100℃10分钟灭活。HBV基因组长约3.2kb不完全双链环状DNA，长链为—链，短链为+链，短链5”末端固定，3”末端不固定。

丙型（HCV）：黄科病毒，球型颗粒，基因组长9.4kb正链RNA，1：1000甲醛液（福尔马林）37度92小时可灭活。母婴、输血、血源性传播。

丁型（HDV）：卫星病毒科，是一种缺陷病毒，需在（HBV）或嗜肝DNA病毒的辅助下才能复制增殖。核心含单股负链共价闭合环装RNA、HDAg抗原，核衣壳是一粗糙球形结构。对各种灭活剂、脂溶剂敏感，耐干热。输注含HDV的血液或血制品。

戊型（HEV）：无包膜线状单股正链RNA病毒球形，基因组长约7.5kb，对高热敏感。有镁、锰离子存在可保持完整性。粪—口传播

115. 人类免疫缺陷（HIV）：是获得性免疫缺陷综合征。简称艾滋病（AIDS），主要通过性接触、血液、母婴传播。感染后损伤免疫系统，引起致死性机会感染或肿瘤，乙类。世界81第一例，我国85。

HIV属逆转录病毒科慢病毒属，分HIV-1、HIV-2型，95%由HIV-1造成，球形，由两条单股正链RNA、逆转录酶、整合酶、蛋白酶、核心蛋白质组成。对理化因素抵抗弱，但在20-22℃活7天，冷冻血制品中需68℃加热72小时才灭活，对紫外线不敏感。

标本：外周全血，抗凝剂：柠檬酸葡萄糖溶液B（ACD）用于新鲜抽提或冻存的血样、肝素、CPD。血量：成、儿10-20ml，婴幼儿1-2 ml，30小时内处理，室温保存。

分离病原：在生物安全3级实验室（BSL-1）、生物安全柜内进行，最敏感的分离技术是共培养，特征性细胞病变为融合细胞。

核酸检测：定性：PCR、RT-PCR技术；定量：逆转录PCR 实验（RT-PCR）核酸序列扩增实验（MASBA）。报告定性结果时应注明反应条件、引物序列，报告定量结果时注明实验方法、样品种类及量。

用ELISA测p24抗原，可使感染的窗口期缩短1左右。HIV-1 p24抗原阳性结果须中和试验确认。WHO及我国推荐HIV感染诊断用：血清学抗体检测（监测、诊断、血液筛查），筛查试剂须是HIV-1/2混合型。确证试验法：免疫印迹试验（WB国常用）、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验（RIPA）、免疫荧光试验（IFA）

116. 脊髓灰质炎病毒：小儿麻痹症，粪—口传播。小RNA病毒科，单股正链无包膜，圆球形颗粒，耐寒-70度保存活力8年，不耐热。按抗原分；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个血清型。脊灰病毒基因组呈单链线性，病毒的主要抗原是VP1蛋白。口服脊灰疫苗（OPV），脊灰Ig G≥1：100为阳性。

标本：粪便（分离主要标本），粪便排出病毒主要在麻痹前期、麻痹后2周内，排毒呈间歇性，故采样在14天内采集2份粪便，时间间隔24—48小时，量5—8克。患者超14天就诊，采5位0—4岁密切接触粪便。粪便须进行氯仿处理，可除支细菌、真菌、有包膜病毒、细胞毒性脂类，使聚集的病毒分散。WHO推荐用：人横纹肌肉瘤细胞（RD）、转人脊灰病毒受体的小鼠肺细胞（L20B）

117. 麻疹病毒：以发热、呼吸道卡他症状和全身丘疹为特征的急性传染病（丙类）。副黏病毒科。病毒为螺旋对称，有包膜，单股负链RNA不分节段，有6个结构基因。包膜表面两种刺突；血凝素HA、血溶素HL，均为中和抗原可诱导产生中和抗体。血凝素HA只能凝集猴红细胞，并能与宿主细胞吸附；血溶素HL具有溶血和使细胞发生融合形成多核巨细胞的作用。只有一个血清型，多个基因型。抵抗力弱。

病原分离：取出疹前3天至疹后3天的咽拭子，尿液标本或血中淋巴细胞，不超过出疹前后5天。细胞分离：Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）、原代外周血单核细胞（PBMC）、B95a细胞（EB病毒转化的绒猴淋巴细胞），WHO推荐使用首选Vero/SLAM分离麻疹病毒；用ELISA方法检测特异AgM抗体进行麻疹诊断。IgM在出疹7—10天达高峰，28天内都能检测到。IgG持续终身。IgG用于人群抗体阳性率调查、抗体水平测定、疫苗初免结果观察。

在结构基因中，H、N基因最易变异的基因。F蛋白是一种具有膜融合特性的糖蛋白。F蛋白、H蛋白都是中和抗原

118. 流行性出血热：又称肾综合征出血热HFRS。由汉坦病毒HV引起的自然疫源性疾病。鼠类为宿主和传染源。单负分节段RNA，基因组分3个片段（L、M、S），分别编码RNA聚合酶、包膜糖蛋白、核衣壳蛋白。A549（人肺癌）传代细胞、Vero-E6（非洲绿猴肾）细胞、2BS（人胚肺二倍体）细胞、RL（大白鼠肺）细胞用于病毒分离。发病5日之内静脉血接种，用标准抗体做免疫荧光试验、标准毒株抗血清做中和试验、交叉阻断试验，ELISA、反向间接血凝试验测抗原。ELISA夹心法用于基层诊断和流行病学调查。目前我国所使用的流行性出血热的疫苗是: 细胞培养灭活疫苗。

我国流行的是Ⅰ和Ⅱ型，伴三痛（头，眼眶，腰）及红（面，颈，上胸部）。新疆出血热病毒。

119. 埃博拉出血热：传染性十分强烈的出血性发热性疾病。单股负链RNA，长丝状。病毒在胞内繁殖，芽生释放。病毒基因组长19kb，由7个连续排列的基因组成，分别编码；核蛋白、基质蛋白、多聚酶、3种小蛋白。

病毒分离必须在生物安全4级实验室进行。急性期血标本接种于Vero-（非洲绿猴肾）细胞培养，或豚鼠腹腔内。用荧光免疫法---病毒抗原积聚在细胞浆内。

120. 流行性乙型脑炎：又日本脑炎，（乙类），经三带啄库蚊传播媒介，猪主要宿主和传染源。属黄病毒科，基因组长11 kb 单股正链RNA，球形，有包膜，根据E蛋白的核苷酸差异将乙脑分为5个基因组。病毒的结构蛋白有：M（包膜内），C（衣壳内），E（嵌在包膜上的糖蛋白）三种，组成血凝素，囊膜内尚有内膜蛋白（M），参与病毒的装配。病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白，在胞浆粗面内质网装配成熟，出芽释放。乙脑病毒以接种卵黄囊最佳，

常用检测标本：血液、脑脊液、尸检标本、蚊虫，保持冷链。最易感染的动物是出生2～3天的乳鼠，经皮下接种，小鼠是常用的动物模型。抵抗力弱不耐热。病毒分离：BHK、C6/36传代细胞。乙脑早期诊断：潜伏期是4—21天，用发病4—7天血液、脑脊液用ELISA测特异性IgM抗体.。

121、登革热DF：乙类，传播媒介伊蚊，属黄病毒科及属，正链RNA，含有一条单一开放读码框架，3个结构蛋白：衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E。E蛋白主要有A、B、C三个不重叠抗原区，为主要的毒粒，能诱导宿主产生保护性中和抗体，直接从标本中分离病毒是确诊登革热的可靠方法。4个血清型，分离细胞（C6/36株）。用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测登革热RNA。检测抗体经典法：血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验

122．克里米亚—刚果出血热CCHE：传播媒介蜱，宿主蜂，又新疆出血热。属布尼亚病毒科、内罗毕病毒属。负链分节段RNA，3个基因节段：

首选乳鼠脑内、腹腔接种，取乳鼠脑组织制成抗体进行血清学交叉试验。反向间接血凝（RPHA）、双抗体心ELISA法检测急性末梢血液，可早期快速诊断。抗体阳性应两种方法同时阳性来最终确认阳性结果。

123．流行性感冒病毒：正黏科分节单负链RNA病毒，多呈球形，核心由RNA蛋白和P蛋白组成，据病毒粒核蛋白（NP蛋白）膜蛋白（MP蛋白）的抗原特性分甲、乙、丙三型，包膜（由血红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA）后者是划分流感病毒亚型的依据，易变异。甲型流感病毒HA易发生点突变，导致氨基酸序列发生替换，造成抗原性漂移，甲型流感血凝素16个亚型、神经氨酸酶9个亚型。

分离有鸡胚和细胞培养两种，常用鸡胚，初次分离以接种9-11日龄鸡胚羊膜腔最佳，后可接种鸡尿囊腔内。易感性最高动物—雪貂，地鼠、小白鼠次之。采样3天内的病例，-70℃冻存。病毒分离是确定流感感染的金标准。

M蛋白的m基因为流感区别于其他病毒的特异基因，m、np、ns基因用于不同型别ABC的检测。

用狗肾传代细胞（MDCK cell）进行分离。NP抗原、HA、NA蛋白用于检测流感的存在。IgG抗体急性期采发病头3天、恢复期发病后2-4周血清。

124．狂大病毒：不分节段单负股RNA，属子弹状病毒科，感染动物或病人中的病毒为：街毒、野毒。传代适应后：固定毒。5种结构蛋白：糖蛋白GP、包膜基质蛋白M2P、衣壳基质蛋白M1P、核蛋白NP、转录酶大蛋白LP，病毒粒子由感染细胞浆膜表面芽生形成，在中枢神经细胞中形成嗜酸性包涵体称内基小体。糖蛋白GP与病毒毒力直接有关。分离：组织、小白鼠分离法。用于检测抗原：核蛋白NP抗原---直接免疫荧光法（DFA）。不形成病毒血症。抗体水平≥0.5IU/ml表示能得到有效保护。

125．腮腺炎病毒MuV：属副黏病毒科，球形，外膜有血凝素（HA）神经氨酸酶（NA）蛋白质突起，基因不分节段单负链疫RNA，7种病毒蛋白的基因：核壳蛋白NP、磷酸化蛋白P、基质蛋白M、融合蛋白F、膜相关蛋白SH、血凝素/神经氨酸酶HN、L蛋白L，仅有一个血清型，有血凝（4、37℃）、血溶（37℃）两种活性，苗接种是预防MV感染唯一有效的手段。

分离：Vero（非洲绿猴肾）细胞分离，表现为细胞聚集、退化性病变，时有产生融合细胞、并形成嗜酸性包涵体。病毒标本采集在发病早期，唾液、尿、脑脊液接种鸡胚羊膜腔、卵黄囊、传代细胞。取羊水进行---红细胞吸咐试验、血凝抑制试验、补体结合试验。SH基因为分型依据，中和抗体决定簇的位点在血凝素/神经氨酸酶HN、融合蛋白F基因上，HN蛋白是主要的V抗原、NP蛋白相当于S抗原。

126．风疹病毒：丙类，属披膜病毒科，单正链RNA，人是唯一自然宿主，易感儿童，潜伏期10—21天，病毒能通过胎盘屏障，造成流产、死亡，发生先天性风疹综合症CRS引起胎儿畸形。出疹前1周至出疹后3—5天有传染性。3个结构蛋白：衣壳蛋白C、E1、E2蛋白，有包膜，小刺突有血凝、血溶两种活性，只有一个血清型，多个基因型，不耐热。病毒分离：脑脊液、泪液、分泌物、损伤组织。

E1蛋白有中和抗体决定簇、凝血活性，含有3种糖基化位点。

127．急性出血性结膜炎：丙类，微小RNA病毒科，单正股RNA，由肠道病毒70型、柯萨奇病毒A24型及其变异株引起。新型肠道病毒70型（EV70）或柯萨奇病毒A24型变种（C A24v），在宿主细胞浆内繁殖复制。对乳鼠不致病，病毒分离阳性可确诊。

128. 致腹泻病毒：丙类，主要病原轮状病毒，其次是肠道腺病毒、杯状病毒、星状病毒、肠道病毒、冠状病毒。病毒侵害十二指肠、空肠黏膜细胞。并在其中大量繁殖。粪—口传播。

轮状病毒：属呼肠孤病毒科，球形，核心蛋白VP6抗原致病有ABC组。外壳蛋白VP4、VP7具有中和抗原活性，主要流行型：G1P—G4P。粪便—密度梯度离心分离病毒，恒河猴胚肾细胞系（MA-104）。

杯状病毒：引起成人和大龄儿童流行性非细菌性胃肠炎暴发流行最重要的病原体。毒粒无包膜，单正链RNA，只有一种衣壳蛋白。潜伏期、排毒期很短（24小时达高峰），无法培养。

肠道腺病毒：致病F亚属，40、41血清型。不能在鸡胚中增殖，只能在人源的组织细胞中增殖，有嗜碱性包涵体，24h换培养液一次，避免细胞毒效应。肠道病毒（单正股RNA）是人类最常见最重要的病毒。急性期粪便密度梯度离心分离病毒，人胚肾细胞株HEK—293、Hela、A549

星状病毒：单股正链RNA，7种血清型，常见Ⅰ型。粪便密度梯度离心分离病毒，人胚肾细胞、大肠癌细胞Caco-2

129．森林脑炎病毒：生物安全4级，属黄病毒科，球形颗粒，单股正链RNA。在感染局部皮下组织细胞中繁殖，经区域淋巴结、远端淋巴结到内脏淋巴组织，在内脏繁殖的同时经血液和神经系统扩散到中枢神经系统。3日内乳鼠脑内和腹腔、7日龄鸡胚卵黄囊接种分离。IgM在病后1周内滴度较高2周达高峰。传播媒介：蜱。

130. 水痘－带状疱疹VZV：VZV疱疹病毒科a亚科，生物学形状与单纯疱疹病HSV相似。线性双链DNA，能在人胚二倍体细胞（HFDK）或人胚二倍体肺细胞（HFDL）中增殖，巨细胞病毒种属特异性高，只能感染人，在人胚纤维母细胞和上皮细胞中增殖，核内有嗜酸性包涵体形似猫头鹰眼。多形性发疹，呈向心分布，病人经呼吸道和直接接触传播，可引起孕妇胎儿畸形、流产、死亡，传染性次于麻疹，高于风疹和腮腺炎，疹前1—2天和出疹后5—6天有传染性。持久免疫。

131. 手足口病HFMD；柯萨奇病毒A16型（Cox A16）和肠道病毒71型（EV 71）最为常见。属小RNA病毒科肠道病毒属，无包膜和突起，没有类脂膜，单正链RNA，在3’末端有多聚腺苷酸尾，去出或断裂则感染性消失。标本；7天内粪便4克、-20℃保存。咽拭子、疱疹液、脑脊淮、尸检标本、双份血1ml。多用Vero（非洲绿猴肾）细胞、GMK细胞、乳鼠接种分离。常用实验室诊断：RT-PCR快速

132．尖锐湿疣病原CV：由人乳头瘤病毒HPV感染，基因组为一双链闭环DNA，所有开放读码框架均位于同一条DNA链上，仅一条DNA链可作为转录模板。目前无法进行有效的病毒分离。乳头瘤病毒HPV诊断分型特异性基因---E6、E7、L1。PCR技术是检测乳头瘤病毒HPV DNA及分型的最好方法。荧光定量聚合酶链反应，能更早期检测出少量HPV感染。

133. 生殖器疱疹病原：疱疹病毒科a亚科，线性双链DNA，HSV-1、 HSV-2有40%序列同源，包含两个血清型，病毒包膜富含磷脂，在PH小于4温度高于56度失去感染性。90%由2型单纯疱疹病毒（HSV-2）引起，可通过胎盘及产道感染新生儿，导致流产及新生儿死亡，与宫颈癌的发生也有关。病毒分离培养是HSV感染实验室诊断的最敏感方法。典型症状---生殖器区域形成密集的、双边分布的疱疹并且伴随有发热、腹股沟淋巴结炎及排尿困难。

标本：感染黏膜伤口、新水疱液、尿液，4度48小时内保存。原代人胚胎细胞、人二倍体细胞用于分离。抗原：放射性核素、生物素标记的探针，电镜观察颗粒，免疫荧光、免疫酶染色

134．非典型性肺炎：严重急性呼吸综合征，02年11月广东佛山，SARS冠状病毒（SARS-Co V），有包膜，上有放射状排列的花瓣样或纤毛状突起，对温度敏感。SARS-Co V，单股正链RNA，与经典冠仅有60%同源性，但基因组的组织形式与其他冠毒相似。包膜双层脂膜，外膜糖蛋白S、M、小衣壳E蛋白。M糖蛋白仅有短的氨基末端结构域暴露于包膜外面，流行中、晚期分离的毒株缺失29个核苷酸序列，某些还缺失一段82个核苷酸序列。密切接触是主要传播途径

标本：血液、鼻咽分泌物、粪便、尿液，出现症状后5—7天阳性率最高。Vero –E6或Vero（非洲绿猴肾）细胞易分离，用空斑进行病滴定。聚合酶链反应方法PCR测病毒核酸，21天时

阳性判断标准：同一病人两个不同部位临床标本检测阳性、至少间隔2天同一病人同种临床标本检测阳性、应确定一个合作实验室以便于对阳性结果进行交叉核对。

N蛋白可作为SARS-Co V早期感染标志，早期（1-10天）出现病毒血症时N蛋白阳性---ELISA法。2次试验复核，并进行双孔测定。抗体中和试验为SARS血清学诊断的金标准。抗体检测包括：IgM、IgG、IgA，或总抗体检测。抗体中和试验检测的是抗SARS-Co V总抗体。ELISA法用的是发病21天后的血清标本结果比较可靠，用IFA法使用发病10天后的血清标本结果比较可靠，血清SARS-Co V IgG或总抗体更可靠。

135．人感染禽流感：由甲型流感病毒引起，属正黏病毒科，分节段单股RNA，有8个基因节段，据血凝素HA和神经氨酸酶NA，有15种HA亚型和9种NA亚型。感染人的亚型H5N1、H9N2、H7N7。H5、H7的高致病性与HA蛋白裂解位点插入的多个碱性氨基酸序列密切相关。

咽分泌物、含漱液、鼻咽及取物、病组织，低温存24小时送检或—70度冻存。在生物安全柜3级实验室进行。病毒分离：鸡胚、细胞。鸡胚为9—11日龄尿囊腔接种；细胞为MDCK细胞。流感病毒分离是诊断的金标准。在发病初期尚未产生抗体只有病毒分离、核酸检测可以进行确诊。编码M蛋白的m、np、ns基因可以用于流感病毒的不同型别的检测。NP、NA抗原用于检测流感病毒的存在。H5、H7、H9亚型抗体阳性（HI抗体或中和抗体效价≥1：80）可诊断疑似。

136．朊病毒：不是病毒,是具有感染性而不含有核酸的蛋白粒子（PrP），即蛋白质病毒。病理改变发生于中枢神经系统，伴有弥漫性神经元退行性变和大脑皮质或神经节的海绵样变，不表现炎症反应，无特异性抗体不能诱发干扰素，对人体T、B淋巴细胞无影响。关键是朊病毒跨越“血液—大脑障碍”的转输，在淋巴器官中复制，进入大脑。

137．EB病毒：人类疱疹病毒。仅能在B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。一般用人脐血淋巴细胞或从外周血分离的B淋巴细胞培养。

138．绝大部分致病性真菌属于半知菌亚门。形态有单细胞和多细胞两种，基本结构：菌丝和孢子，鹿角状菌丝仅见于黄癣菌，假菌丝与真菌丝的主要区别是它壁两边有时交叉，是由孢子延长而来，有性孢子有：卵，接合，子囊，担。无性孢子有：叶状，分生，孢子子囊。最常用沙保弱氏，最适温22～28℃，最适pH5～6，培养4周以上，真菌菌落三型：酵母型，酵母样，丝状。可用10%氢氧化钾加热使标本透明。血清出芽试验有芽管出者为白念菌，念珠菌中仅白念菌产厚壁孢子，试管培养是真菌分离，传代，保存菌种最常用的方法。鉴定曲霉常用察氏琼脂，以烟曲霉菌居多。

139. 葡萄球菌食物中毒，动物接种的鉴别---幼猫，口腔。

对人致病的厌氧主要是衣氏和牛氏放线菌，可见硫磺颗粒（放射状），需氧主要是诺卡菌和马杜拉放线菌（主要致病是足分枝菌）。星形诺卡菌致病最强，其次是巴西和豚鼠，抗酸染色有一定抗酸性可初步确定为诺卡菌。

140. 微生物学检验中常用标记技术：免疫荧光、放射性核素、酶联

141. 定量评价抗菌药物杀菌效力的试验主要是最低杀菌浓度（MBC）和杀菌曲线。

142. 抑菌浓度指数（FIC），﹤0.5协同作用，0.5～1相加作用，1～2无关作用，﹥2拮抗作用。

143. 目前院内感染主要是G－杆菌。

144．在细菌的对数生长期，有几个重要的指标用来反映微生物生长的情况。

　　分裂的次数：以n表示，即一个单细胞微生物一分为二的次数。

　　生长速率常数：以R表示，指每小时细胞分裂的次数。

　　代时：以G表示，指细胞每分裂一次所需要的时间。

145. 肝素抗凝全血不影响病毒培养。嗜神经病毒最好接种小鼠脑内，包涵体检查不是特异性检查。

146.过滤式微生物采样器根据过滤材料不同分为：薄膜、玻璃纤维、凝胶、谷氨酸碱过滤器

147. 破碎细菌细胞常用方法：酶、SDS、超声波破碎、二乙胺十六烷基处理

148．《化妆品卫生规范》

化妆品微生物指标	细菌总数	粪大肠菌群	霉菌、酵母	金黄色葡萄球菌	铜绿假单胞菌
其他化妆品	≤1000 CFU/ml/g	不得检出/ml	≤100 CFU/ml/g	不得检出/ml/g	不得检出/ml/g
眼部、口唇、婴儿、儿童化妆品	≤500 CFU/ml/g	不得检出/ml	不得检出/ml	不得检出/ml/g	不得检出/ml/g

149.《化妆品卫生规范》

	培养基	备注
化妆品细菌总数	卵磷脂吐温80营养琼脂	为区别细菌与颗粒，加入0.5%的TTC溶液，菌落呈红色，卵磷脂中和防腐剂
化妆品粪大肠菌群	伊红亚甲蓝琼脂平板EMB	深紫黑色、具有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；粉紫色，菌心较深色。靛基质阳性（瑰红色）
化妆品霉菌和酵母	虎红培养基
化妆品金黄色葡萄球菌	Baird Parker平板、血琼脂平板	甘露醇+、血浆凝固酶+，可导致败血症
化妆品铜绿假单胞菌	十六烷三甲基溴化铵琼脂平板或乙酰胺替代	产生绿脓菌素、氧化酶+、液化明胶+、硝酸盐还原+、42℃±1生长，菌落灰白色，有水溶性色素

151．《化妆品卫生规范》：分别从两个包装单位以上样品中共取10 ml/g，包装＜20g，取样＞16g，不能即时送检，需室温保存。若检出粪大肠菌群或其他致病菌，自发报告之日起样品应保存30天。

疏水性样品、油性液状样品+液状石蜡+吐温80在40—44℃混10分钟。培养36℃±1，48±2小时

粪大肠菌群: 需氧及兼性厌氧G-无芽胞杆菌，在44.0℃培养24-48小时能发酵乳糖产酸产气。伊红亚甲蓝琼脂36.0℃培养18-24小时，同时接种蛋白胨水44.0℃培养24小时。

金黄色葡萄球菌：大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐温80培养基/SCDLP液体培养基，或用7.5%氯化钠肉汤替代. Baird Parker平板菌落圆形凸起湿润灰色到黑色,边为淡色周围为一混浊带。

霉菌和酵母数测定：化妆品检样取1 ml/g中所污染的活的霉菌和酵母数量，虎红培养基28℃±2，72小时，选择5—50个范围之间的平板计数CFU/ml/g

152、生活饮用水水质微生物检测

玻璃或聚丙烯容器用硝酸溶液（1+1）浸泡后洗净，灭菌前加入硫代硫酸钠还原余氯。每125ml+0.1 ml 10%（100g/L）硫代硫酸钠,121℃高压15分钟,干热灭菌法160--180℃ 2小时。

GB/T5750.12-2006生活饮用水现行标准；GB17324-2003瓶（桶）装饮用纯净水；

	细菌总数（48H）	总大肠菌群MPN	霉菌、酵母	金黄色葡萄球菌	铜绿假单胞菌
城市饮用水GB/T5750.12-2006	≤100 CFU/ml	不得检出/L
瓶（桶）装饮用纯净水GB17324-2003	≤20 CFU/ml		不得检出/ml

MPN-100 ml水样中总大肠菌群最可能数。每个稀释度5个发酵管，共3个稀释度15管。培养液-二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液

饮用水控制项目			分离培养	证实试验	备注
饮用水细菌总数		营养琼脂
总大肠菌群	乳糖发酵试验	乳糖胆盐培养基	伊红亚甲蓝EMB	乳糖蛋白胨液
	滤膜法试验0.45um	品红亚硫酸钠			紫红或红、金属于光泽。菌落数*100/水样体积
	酶底物法试验	马铃薯糖琼脂培养基（MMO-MUG）35℃			黄色+
耐热大肠杆菌	多管发酵法	EC培养基44.5℃24H	伊红亚甲蓝EMB		MFC培养基菌落蓝色
大肠埃希菌	多管发酵法	EC- MUG管44.5℃24H	MUG		在366紫外光下蓝色荧光
	滤膜法试验0.45um			产生B-葡萄糖醛酸酶
	酶底物法试验			产生B-半乳糖苷酶，培养呈黄色
贾第鞭毛虫和隐孢子虫	贾第鞭毛虫：原虫类寄生虫，2个种，宿主人、鼠。隐孢子虫：原虫类寄生虫，6个种，宿主哺乳动物、鸟、鼠、爬行、鱼。采样：原水20L、处理水100L，孔径1um，褶聚醚砜滤纸的滤囊，压力2.1巴/30,流量2L/分钟,4℃72小时保存。				贾卵圆形、隐球形

	选择性培养基	培养基	生化鉴定试验
铜绿假单胞菌		SCDLP液体培养基	G-氧化酶+绿脓菌素+或液化明胶、硝酸盐还原产气、42℃生长+
金黄色葡萄球菌	7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤	SCDLP（化妆品样制备，前增菌培养）液体培养基	甘露醇发酵+ 血浆凝固酶+
志贺菌		GN增菌液
粪大肠菌群	最佳分离平板：伊红亚甲蓝EMB	EC肉汤培养基	EMB深紫黑色,带金属光泽;紫黑色不带或带金属光泽;粉紫色
沙门菌		BP、MM、SC增菌
蜡样芽胞杆菌	甘露醇卵黄多黏菌素MYP		粉红色菌落，周围有粉红色晕，产生卵磷脂酶所致
单增李斯特菌G+	胰酪胨大豆培养基	30℃EB48H、LB24H	三糖、动力，呈伞或月芽生长
产气荚膜梭菌		SPS
副溶血性弧菌		3.5%氯化钠肉汤（增菌）
霍乱	庆大霉素
肠道致病菌	麦康凯（抑制剂胆盐）
溶血性链球菌	血平板、匹克肉汤、	葡萄肉汤浸液（增菌）	链激酶、杆菌肽试验
空肠弯曲菌		布氏肉汤（增菌）	42℃，微需氧
小肠结肠耶尔	GIN-1、改良克氏Y	改良磷酸盐缓冲液（增菌）	GIN-1红色牛眼状菌落。尿素+、动力+、V-P+、鸟氨酸+、甘露醇+、山梨醇+

为防止人工游泳池生长藻类，加入0.25---0.5%mg/L硫酸铜。

153．GB18466-2001《医疗机构污水排放要求》2002年3月1日颁布，GB18466-2005《医疗机构水污染排放标准》2006年1月1日颁布，取样200ml；

传染病、结核病医疗机构水污染排放控制项目：粪大肠菌群数100、肠道致病菌、肠道病毒、结核杆菌、总余氯0.5

综合医疗机构和其他医疗机构水污染排放控制项目：粪大肠菌群数500、肠道致病菌、肠道病毒、总余氯0.5

①医疗机构水污染中粪大肠菌群的检验程序：污水200ml、污泥200g稀释处理→乳糖胆盐发酵试验44℃→EMB平板分离→革兰染色鉴定→乳糖蛋白胨培养鉴定→计数，报告结果。

②医疗机构沙门菌的检验程序：污水稀释处理→双倍浓缩SF增菌→SS平板、BS平板分离→三糖铁生化鉴定→血清学鉴定→计数，报告结果。生化：葡萄糖+、甘露醇+、麦芽糖+（猪、雏-）、硫化氢+、乳糖-、蔗糖-、靛基质-、尿素-、动力+（鸡、雏、伤-）

③医疗机构志贺菌的检验程序：污水稀释处理→双倍浓缩GN增菌→EMB平板分离→三糖铁生化鉴定→血清学鉴定→计数，报告结果。

④结核菌的检验程序：污水集菌→改良罗氏（小川）培养基培养（2周或8周淡黄色或无色粗糙菌）→抗酸染色初步鉴定→致病力试验点→计数，报告结果。污水集菌：过滤离心法或直接离心法。乙酸纤维滤膜（0.3—0.7）水样500ml抽滤，沉淀物用4%的硫酸处理30分钟。致病力试验：小白鼠尾静脉接种。

⑤蛔虫卵检验方法：检测污泥蛔虫时，100g样品中加入5ml 3%盐酸或3%甲醛4-10℃保存，以防止微生物繁殖和蛔虫卵的发育。如有余氯则取样后立即用5%硫代硫酸钠中和。

蛔虫卵收集：1、分离、50 ml 5%氢氧化钠2、水洗3、漂浮—饱和硝酸钠或饱和氯化钠（量20倍于沉淀物）4、沉淀

镜检：加入30%次氯酸钠A死亡率=M死亡蛔虫卵数/ M死亡蛔虫卵数+存活蛔虫卵数*100%

		抑制剂	营养物	鉴别用糖
SS平板	强选择性培养基	煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸盐	牛肉浸膏蛋白胨	乳糖

154．空气微生物检测：撞击法---对空气微生物捕获率达95%。自然沉降法---通常设置5个采样点，高度1.2—1.5M，采样点离墙1M以上。皿暴露5分钟。

155．茶具微生物检测：采样---茶具内外缘1—1.5cm高处一圈涂抹50cm24小时内送样。或5cm×5cm纸片两张贴30秒。

156．毛巾、床上卧具微生物检测：毛巾、枕巾对折后两面的中央各25cm2（5cm×5cm），床单、被单上下两部位各25cm2

157．拖鞋微生物检测：鞋面与脚趾处（5cm×5cm）涂抹三次，一双为一份样，共50cm2

游泳池水微生物检测：1、采样瓶的预处理：灭菌前125ml+0.1 ml 10%（m/m）硫代硫酸钠,121℃高压20分钟。 2、滤膜在蒸馏水中煮沸15分钟，灭菌3次。前两次煮沸需更换水洗涤2—3次除去残留溶剂。滤器用121℃高压20分钟或点燃的酒精棉球火焰灭菌。水样在-0.5个大气压下抽滤。

158．浴盆、脸（脚）盆微生物检测：选择盆内侧壁1/2--1/3高度采样。浴盆四壁、盆底梅花5个布点，放入125ml。脸（脚）盆在相对两侧壁2个布点放入50ml生理盐水中。1ml相当于1cm2

159．SARS的检测方法描述：1、用ELISA可检测SARS病人血清中的抗体（发病21天后的血清标本所得结果比较可靠）。2、IFA可作为血清SARS-CoV抗体检测方法3、用RT-PCP检测特异的SARS-CoV RNA片段，但阴性结果不能排除感染 4、Ver0利用可分离SARS-CoV，但阴性结果不能排除感染。血清学诊断的金标准是：SARS冠状病毒中和抗体试验，检测的是总抗体；SARS-CoV在Ver0-E6细胞中培养滴度最高

大肠埃希菌质粒：F因子、R因子、col因子（大肠杆菌素因子）

SPA：金黄色葡萄球菌A蛋白

食品卫生微生物检验