《生物信息工程》6-7章

第陆章 Overview of the next generation sequencing technology

6.1 What is Next Generation Sequencing Technology?

测序：把DNA上的核苷酸顺序测出来

第一代：

1. 二代测序技术简介

高通量 ； 序列短

6.2  Platform overview

6.2.1 Illumina Genome Analyzer

Illumina测序平台技术和测序原理

扩增技术： 桥式扩增

方法： 边合成边测序

扩增过程：

1：在样本里面获得DNA序列 ,序列两端接上接头（Adapters）； 

2:   固定在装置上，处理成单链DNA； 

3:   把单链DNA变成桥式的结构，加入游离的四种碱基，把序列进行无限扩增；

4： 一次扩增后，将桥型竖直，再进行上述步骤进行扩增。

测序过程：边合成边测序

1：扩增过程结束以后，加上标记上颜色的四种碱基（A,C,G,T）

2： 边合成时，边用激光扫描，测其颜色和序列

3： 读出互补链的顺序，再通过碱基互补配对的原则，得出模板链的核苷酸顺序。

6.2.2 SOLiD: Sequence-by-ligation

SOLiD测序平台技术和测序原理

最大的区别

颜色的编码，SOLiD是双碱基编码，而Illumina是单碱基编码

过程：

人工合成

一个如下探针

一种颜色标识256个探针

前五个是正常的脱氧核苷酸，后面三个是通用碱基

前两个核苷酸探针决定标记的颜色是什么。

测序过程

 

一轮反应只知道颜色，而不知道碱基

设计引物，与接头进行碱基互补配对，加入1024种颜色探针，从待测序列的第一个到第八个bp，只有唯一一种颜色探针与其互补配对。

二次重复时，把引物往前错一位，把第一个位置留了下来，重复过程

优势

可以识别测序错误，可以分别是测序错误（只改变一个颜色）还是基因的突变（连续改变两个颜色），简单易操作

不足

工序繁琐

6.3 Biological applications

二代测序技术的生物学应用

测DNA

• 从头测序
• 基于参考基因组的重测序
• 宏基因组(微生物)

测RNA

• 基因的表达
• miRNA和一些新的非编码RNA

研究蛋白质和DNA/RNA相互作用

• ChIP-seq 转录因子和DNA结合位点的位置
• CLIP-seq  RNA和蛋白质相互作用

表观遗传学

• DNA 碱基化
• 组蛋白修饰
• 染色质结构
• 核小体定位

DNA测序

• 全基因组的测序（人和动物）
• 癌症基因组研究
• 靶向基因组测序（只测基因组的一部分）
• 混合基因组测序
• 拷贝数变异
• 结构变异

RNA测序

• 测基因的表达量
• 

6.4 Data processing workflow

1. 二代测序数据分析基本流程

类别

大小

流程

2. 二代测序数据的质量分数

测序的质量

1. 比对的质量
2. 碱基的质量
3. 识别的质量

质量分数

     p是测错的概率，acc是成功的概率

6.5 Sequence Alignments

1. 二代测序数据比对算法介绍

按照目的区分： 1：全局比对（从头比到尾）；     2：局部比对（中间找到一个最佳匹配）

最佳匹配措施

比对上+1；没比对上+0；罚分：空位-3，扩展+0.1

算法设计

从矩阵的最后一个元素，往回回溯

如果有负分和0进行比对

2. 基于前缀树／后缀树的BWT短序列快速比对算法

是可以还原回去的

  

6.6 Genome assembly

6.6.1 K mer counting

K－mer频次计算方法和意义

基因组组装的第一步：计算长度为k的基因组出现的次数或频率

挑战

• 计算量巨大
• 测序可能导致出现错误
• 将所有存储在内存困难
• 存储在硬盘中困难
• 开发并行技术去提高速度

 一次两次高，是测错导致的，去掉不影响结果

过程

1. 对四个碱基进行编码 A（00），C（01），G（10），T（11）。
2. 
3. 比对时，取编码小的

算法

• 基于哈希表的算法   

常用算法

分而治之

不存在相同的 k-mers 在minmizer当中

升级

6.6.2 Genome Assembly

二代测序数据组装算法

从头组装

算法

贪心算法

出错

耗时

基于欧拉图的算法

使用K-mers 可以处理测序错误：出现错误就会出现气泡，产生分支

测错了的频次是很低的，通过频次可以区分杂合子和测试错误

过程

1. 测序
2. 构建布鲁因图
3. 简化
4. 错误移除

K的选择

第柒章 DNA-seq, RNA-seq and ChIP-seq

7.1  DNA-seq Introduction and Application

1. 基因芯片简介DNA-seq的基本原理与数据分析流程

方法：

2. 遗传变异与表型的概念

遗传变异

       

SNP

结构变异

研究原因

大部分变异不会引起疾病

并不是所有遗传变异都会引起疾病

7.2   DNA-seq Refined alignment

基因芯片简介DNA-seq精确比对的前提条件和方法

拿样本序列和参考基因组进行比对，比对错的地方进行局部重新比对即可

重比对的步骤

7.3   Variant identification

序列变异的识别算法

只使用于二倍体生物基因组

变异 

 纯和变异（变的一样） 杂合变异（部分一样，部分不一样）

措施

      

结构变异

通过显示器去测量重复度进行比对

7.4  Overview of RNA-seq experiments

1. 基因表达、RNA剪切的概念

功能

可以测基因表达的范围(等级)  ；  可变（选择性）剪切；  等位特异的表达                   

2. RNA-seq的基本原理

1. 先逆转录成cDNA
2. 打成片段
3. 接上接头
4. 测顺序
5. 与参考基因组比对片段

得出的结果

1: 基因表达水平-----> 计算差异表达；  2：选择性剪切；  3：转录层面的变异；     4：非编码RNA

3. RNA-seq与基因微阵列的区别

好处

• 不依赖于已知的基因结构 可以测（蛋白编码基因，非编码RNA，功能元件，基因融合）

差别

基因表达水平的范围

7.5  RNA-seq data analysis

1. RNA-seq数据分析流程

挑战

• 序列比对
• 转录组的重构
• 表达水平的变量

序列比对

   

利用的工具

基因表达水平

影响条件

• 基因长度
• 测量深度
• 基因表达的程度

2. RNA-seq代表性比对算法的基本原理

表达:

1:   取并集表达

2：取交集表达

差异表达分析

选择性剪切的问题

判断基因融合

基因融合问题判断

7.6   ChIP-seq

1. 蛋白质结合、染色质状态等概念

2. ChIP-seq的基本原理

例子：

生物学应用： 转录因子结合位点

组蛋白修饰

步骤

1：峰值检测

峰值的类型

          转录因子                                                                             RNA聚合酶

组蛋白修饰