文件导出 流式_【指南】基于荧光素的高参数流式实操指南（二）

针对高参数流式，上一讲给大家分享了如何制作完备的流抗和靶标信息图、利用CST和Unstain cell优化仪器设置(【指南】基于荧光素的高参数流式实操指南(一))，今天继续为大家带来仪器优化设置之电压滴定(Voltration)和染料染色指数(Stain Index，简称SI)计算。Voltration可以帮我们了解荧光素在流式细胞仪上的最佳分辨率对应电压，而SI则可帮助我们了解不同荧光素在特定仪器上的表现。无论是最佳电压，还是SI，都和仪器本身配置和状态有密切相关，这也是不同仪器的panel设计不可随意套用的原因。总之，了解自己流式细胞仪的“脾气”和染料特性，是设计出优秀panel的先决条件。下面我们来一步步看下如何用单染细胞做电压滴定图和染色指数图吧！

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制作电压滴定图

电压滴定(Voltration)：除非是光路发生变化(如激光，滤光片，或检测器变动)，电压滴定在每一台流式细胞仪只需执行1次。下面我们将主要阐述如何用细胞单染法获得电压滴定图和染色指数图。

1. 获取抗体(如anti-CD4或anti-CD8)的所有荧光形式(仪器可检测的所有通道)。

2. 制备细胞(冻存的PBMC或小鼠脾脏细胞)

3. 使用stain buffer配制抗体，注意抗体量需为过量。

4. 按500,000 cell/well 铺在96孔板中

5. 400g 离心板子5min ，去除干净上清。

6. 每孔加入100ul 已经配制好的抗体，重悬，RT 孵育20min

7. 孵育