![fa0a16ad5d90fdd041fee77256ceb4f1.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/fa0a16ad5d90fdd041fee77256ceb4f1.png)
共有的特点:
优点:无需前期扩增,不引入偏向性;读长长
缺点:错误率高;
10X Genomics:Illumina二代测序的升级版
10X其实并不属于三代测序技术,不过它的测序长度比较长,所以这里也顺便介绍一下
10X Genomics,是常规Illumina二代测序的升级版,由于开发出了一套巧妙的Barcoding建库方案,使得Illumina这种短读长二代测序能够得到跨度在30-100Kb的linked reads信息,与二代测序数据相结合,在Scaffold的组装上能够得到媲美三代测序的组装结果
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首先将每一条长片段的DNA分配至不同的油滴微粒中,通过专利的GEM建库技术,长片段DNA被切碎成适合测序的大小,并且来源于相同油滴(同一条长片段DNA)的DNA片段,会带上相同的一段DNA序列标记(Barcode),之后在Illumina系统上测序完成后,可以理论上再将来源相同的DNA序列独立拼接,得到原先的长片段DNA序列
其GC偏好性如何?
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10X Genomics技术相对于Illumina来说,有改进,但依旧是个拱形,而PacBio则是无偏倚的均一分布。10X的技术,其Coverage一样是受GC含量影响较大的,那么如果真要应用10X技术,那么必须注意目标DNA的GC含量分布最好能控制在30~70%
Helicos:tSMS
真正的单分子测序(Helicos True Single Molecule Sequencing)
![46355a24483cd78122c17b059627fcf2.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/46355a24483cd78122c17b059627fcf2.png)
待测DNA 被随机打断成小片段,在每个小片段( 200bp)的末端加上poly-dA,并于玻璃芯片上随机固定多个 poly-dT 引物,其末端皆带有荧光标记,以利于精确定位
首先,将小片段 DNA 模板与检测芯片上的poly-dT 引物进行杂交并精确定位,然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与 Illumina 的终止子可不一样,不是四色的,是单色的,也就是说所有终止子都标有同一种染料
在掺入了单个荧光标记的核苷酸后,洗涤,单色成像,之后切开荧光染料和抑制基团,洗涤,加帽,允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环,即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助,可分析出完整的核酸序列
缺点:Heliscope 在面对同聚物时也会遇到一些困难,但可以通过二次测序提高准确度;由于在合成中可能掺有未标记的碱基,因此其最主要的错误来源是缺失
PacBio:SMRT
PacBio SMRT(single molecule real time sequencing)技术也应用了边合成边测序的思想,并以SMRT 芯片为测序载体
基本原理是:DNA 聚合酶和模板结合,4 色荧光标记4 种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型
DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响
PacBio SMRT 技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来:
它们利用的是 ZMW(Zero Mode Waveguide,零模波导孔)原理,如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来,从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围,而是保持直线状态(光衍射的原理),从而可起保护作用。同理,在一个反应管(SMRT Cell,单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,即ZMW(零模波导孔),外径 100 多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围(体积 20x10-21L )里,正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低
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优缺点:
- 优点:
(1)可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间,来检测一些碱基修饰情况,即如果碱基存在修饰,则通过聚合酶时的速度会减慢,相邻两峰之间的距离增大,可以通过这个来直接检测甲基化等信息
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(2)测序速度很快,每秒约10 个dNTP
(3)读长长
(4)无需PCR扩增,也避免了由此带来的bias
![88e78d363efe1a1156a1e780841b213d.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/88e78d363efe1a1156a1e780841b213d.png)
(5)需要的样品量很少,样品制备时间花费少
- 缺点:
(1)测序错误率比较高(这几乎是目前单分子测序技术的通病),达到15%
![e96a85bc2115e6b4a519bb725c6cb749.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/e96a85bc2115e6b4a519bb725c6cb749.png)
好在它的出错是随机的,并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向,因而可以通过多次测序来进行有效的纠错
Nanopore sequencing
该技术的关键之一是,它们设计了一种特殊的纳米孔,孔内共价结合有分子接头。当DNA 碱基通过纳米孔时,它们使电荷发生变化,从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的),灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基
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测序原理:
1、解螺旋,将双链DNA解开成单链
2、DNA单链分子通过一个孔道蛋白,孔道中有个充当转换器的蛋白分子
3、DNA单分子停留在孔道中,有一些离子通过带来电流变化,而不同的碱基带来的电流变化是不同的
4、转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化
5、根据电流变化的频谱,应用模式识别算法得到碱基序列
特点:
- 测序读长
因为测序原理无需要DNA聚合酶的链式反应,所以不存在DNA聚合酶的失活问题,理论上只要DNA分子不断开,就一直可以通过纳米孔,目前在对于人和大肠杆菌的测序种观测到的read是1Mb。
要问测多长,请问您提取的DNA是否够长?
三种不同建库方法Nanopore测序情况
![85be1ac9361fff79dd1c4ea8378808c1.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/85be1ac9361fff79dd1c4ea8378808c1.png)
- 测序准确率
Nanopore测序准确率和Pacbio持平,为86%左右。而且起始位置正确率偏低,在大约100nt位置达到稳定,且错误为随机测序错误。
![cb5980a1d8b4b10825e50a1ab5e27561.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/cb5980a1d8b4b10825e50a1ab5e27561.png)
如果选择 1D2测序方式,即对于DNA的正负链都进行测序,可以达到96%的准确率
![d3ff0bd507749c28d4ece82dd0689d98.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/d3ff0bd507749c28d4ece82dd0689d98.png)
Nanopore 测序仪 MinION 的一些特征:
1、早期使用基因工程改造过的a-hemolysin蛋白,称为作为biosensor,最新的nanopore使用CsgG 蛋白,它允许ssDNA通过
2、MinION的flow cells中有512 channels,每个channel含有4个pores和sensors,每个channel作为一个独立的测序单元,对一条DNA分子进行测序,DNA分子从四个纳米孔中的一个穿过,产生电流信号。因此一个flow cell可以同时对512条DNA进行测序
3、为了进行dsDNA的测序,需要在dsDNA的两端加上两个接头:leader-adapter 和 hairpin-adapters,且都被预先固定在马达蛋白 (motor proteins) 上
![f65073d8ec0eec9d54c72663904a19a5.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/f65073d8ec0eec9d54c72663904a19a5.png)
leader-adapter带着dsDNA到邻近的纳米孔,然后原先固定在leader-adapter的马达蛋白开始将dsDNA打开,使得第一条链,即模板链(template),能够穿过纳米孔,测序过程随即开始
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4、MinION的flow cell有多个升级版本(R6.0, R7.0, R7.3, R9 and R9.4),在通量,读长和准确率方面都有很大的提高
![3b6563fa6285a9e3dee50946a0ff1a82.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/3b6563fa6285a9e3dee50946a0ff1a82.png)
5、纳米孔中的电流传感器的采样频率为5000 Hz,测序速度为250 bases/s(早期为75 bases/s)
6、目前唯一的便携式DNA和RNA测序仪,注意这里有两个概念,一是便携式,MinION只有100g重,相当于1个大一点的U盘或者小一点的移动电源;二是DNA和RNA测序,和所有NGS测序仪、甚至三代Pacbio不同的是,MinION和其他的ONT仪器们,可以直接对RNA进行测序,无需预先转化为cDNA。此外,一旦启动测序,实时的数据会不断产生,而不用像传统的NGS测序中一个run结束后才能收获数据,一旦数据量足够可随时终止测序进程,简直不要太爽!
ONT公司目前推出的几款测序仪:
- MinION —— flow cell最新版本是R9,内含2048 wells。48h即可产出10~20 Gb数据
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- GridION X5 —— 一款桌面式测序仪,通量介于大家熟悉的MinIon和高通量的PromethIon之间。GridIon X5系统一次最多可运行五个MinIon flow cells,可以根据实际数据量的需求一次运行1~5个flow cells。目前的最大通量是,每运行48小时可产出高达100 GB的测序数据。
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- PromethION —— 一个具有模块化设计的更大的台式测序仪,其在全功率时的运行能力约为MinION的300倍,通量在Tb级。包括48个flow cells,这些flow cells可以单独运行,也可以一起运行
![3e08e24c8f6b4467a15508dd22344e43.png](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/3e08e24c8f6b4467a15508dd22344e43.png)
参考资料:
(1) 天津医科大学,伊现富《系统生物学-chapter2》
(2) Nanopore 第四代测序技术简介
http://blog.sciencenet.cn/blog-717048-1082367.html
(3) Magi A, Semeraro R, Mingrino A, et al. Nanopore sequencing data analysis: state of the art, applications and challenges.[J]. Briefings in Bioinformatics, 2017.
(4) 细节曝光!Oxford Nanopore真机还原,听听圈内人怎么说
http://baijiahao.baidu.com/s?id=1578927576255577196&wfr=spider&for=pc
写在文末
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