链接:https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/saxs/saxs_mw.html。
翻译:刘广峰
这是RAW-BioSAXS教程的第二篇,本教程涵盖了根据SAXS数据计算分子量的基本原理和操作。具体的操作可以参看之前的一篇:分子量的计算。
概述
有许多方法可以根据SAXS数据计算分子量。RAW程序支持四种最常用的方法:
Ø 利用绝对强度I(0)计算分子量[1]。
Ø 通过与参考标准进行比较计算分子量[1]。
Ø 利用Porod参数计算分子量[2]。
Ø 利用体积相关性计算分子量与[3]。
ATSAS软件还支持两种其他方法,如果安装了ATSAS,RAW将显示这些方法:
Ø 通过将散射与已知结构进行比较来估算分子量[4]。
Ø 通过贝叶斯推论从其他分子量方法计算分子量[5]。
所有这些方法都有优缺点,要使用和信任哪一种方法在一定程度上取决于数据的详细信息。无论如何,计算分子量对于验证样品的低聚状态很重要。
为什么要计算分子量?
SAXS分子量计算并非十分准确,通常的经验法则是不确定性约为10%(或更高)。因此,不应使用SAXS来确定样品的分子量,诸如多角度光散射(MALS)之类的方法更加准确。根据SAXS数据计算分子量的主要原因是要确定溶液中蛋白质的低聚状态。特别是如果正在研究可以形成同二聚体或更高阶低聚物的系统,则SAXS分子量计算应足够准确,以表明要测量的低聚物状态。因此,分子量是一种重要的诊断方法,可用于验证溶液中的成分。
如何计算分子量?
因为有很多方法可以根据SAXS数据计算分子量,所以这里仅列出上面提到的方法的简短摘要。一般而言,这些方法可分为两类:浓度依赖型和浓度无关型。依赖于浓度的方法需要知道SAXS池中样品的浓度,这通常意味着它们与SEC-SAXS测量不兼容。浓度无关的方法不需要了解浓度,因此对于SEC-SAXS测量非常有用。
通过绝对强度I(0)计算分子量
SAXS数据通常置于绝对比例上,因此强度值具有单位(通常为cm-1)。这意味着I(0)值可以直接与样品中的电子数量、样品的浓度和对比度相关[6]。如果已知样品的浓度和对比度,则可以计算电子总数,然后将其用于确定样品的分子量。这种方法的准确性可以通过测量或计算蛋白质微分比容(例如,使用MULCh)来提高。如有必要,调整样品和缓冲液的电子密度也会提高准确性。分子量计算公式如下:
其中MW是分子量,c是浓度,NA是阿伏伽德罗常数,ΔρM是单位质量