3、 4. 解吸附阶段:用梯度缓冲溶液洗脱,先洗下弱吸附物质,后洗下强吸附物质
5.再生阶段:用原始平衡液进行充分洗涤,既可重复使用
亚基与原体
四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基。亚基一般只是一条多肽链,但有的亚基由二条或多条肽链组成,这些多肽链之间以—S—S—相连。四级结构有时还指相同的或不同的球蛋白分子所构成的聚合体。对称的寡聚蛋白质可视为两个或多个不对称的相同结构成分组成,这种相同结构成分称为原体(protomer)。在同多聚体中原体是亚基,但在杂聚体中原体是两种或多种不同的亚基组成。
蛋白质变性后的变化
由于外界因素的作用,使天然蛋白质分子的构象发生变化,导致生物活性丧失及物理化学性质的异常变化,这一过程称为变性(denaturation)。变性涉及次级键的断裂,但不涉及共价键(肽键和二硫键) 的断裂,因而一级结构并未破坏。
①生物活性的丧失
②侧链基团的暴露
③物理化学性质的改变: 溶解度.分子形状. 粘度等.
④化学性质的改变变性后的蛋白质肽链松散,内部侧链基团暴露,易于与有关显色试剂接触,使颜色反应增强。
⑤生物化学性质的改变:易被蛋白酶水解
变性机理
①温度:温度升高,使分子内振动增强,破坏维系空间结构的次级键的作用(主要是氢键),使蛋白质变性。
②酸、碱:主要是由于解离基团质子得失后,生成过多正或负电荷,使肽链间静电斥力增加的结果
③有机溶剂
A. 由于有较低的介电常数,常使肽链内静电斥力增加,造成蛋白质分子膨化或松散;
B. 在极性较低的有机溶剂环境中,疏水基团易于从内部向外部转移,使疏水作用力削弱,促进蛋白质的变性。
④重金属盐
在溶液中加入重金属盐类也会影响蛋白质构象的稳定性。重金属盐有可能和蛋白质的极性基团直接作用,使稳定性发生变化,也可能通过改变溶剂的结构间接影响蛋白质的结构。
鉴定变性的方法
①测定蛋白质的比活性
②测定蛋白质物理化学性质的变化
③测定蛋白质生物化学性质的变化
④用免疫法测定蛋白质的抗原性是不是改变
⑤蛋白质的溶解度是不是下降。
蛋白质组学研究内容
蛋白质组学的主要研究内容:
1)、蛋白质组表达模式(或蛋白质组组成)的研究,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类
2)、蛋白质组功能模式(目前主要集中于蛋白质的相互作用网络关系)的研究
3)、描绘蛋白质的精确三维结构,揭示其结构上的关键部位,如与底物结合并且决定其活性的部位
研究方法:
蛋白质组学研究的策略和趋势:
策略包括穷尽法和差异法;研究趋势包括:相互作用蛋白质组学、亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学。分离技术:
1)、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳:
第一向进行等电聚焦电泳,根据蛋白质的等电点不同对蛋白质进行初步分离。
第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,按照分子量不同对蛋白质进行再次分离。
2)、高效液相层析:
其第一向根据分子大小分离蛋白质,第二向反向层析(固定相和流动相所有溶剂相反)。
鉴定技术: