技术中台构建思路及进展_【综述】用于复杂组织构建的多工艺混合制造技术进展...

最新推荐文章于 2020-12-09 00:45:42 发布

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文章标签：技术中台构建思路及进展

用于制造3D植入物、支架和组织构建物的制造方法越来越多，包括静电纺丝、近场直写、生物3D打印、生物组装等。然而，单一的制造技术很难满足复杂仿生结构的体外构建。因此，在生物制造领域，多种不同制造技术的结合，被视为一种明确而必要的新兴趋势。这种混合方法允许更复杂的力学和离散的仿生结构来处理机械转导和趋化/趋触性的因素。近期，维尔茨堡大学的Paul D. Dalton教授在Advanced Science发表了题为“Advances in HybridFabrication toward Hierarchical Tissue Constructs”的综述，总结了应用于生物医学领域的混合制造的开创性论文，并分析了混合制造的未来趋势。1. 混合制造技术发展现状

Figure 1以时间轴的形式描述了针对复杂三维组织构建的不同制造技术融合的突破性论文。作者认为，所有以下的技术最终都将被整合到一个完全自动化的生物制造系统中，这种混合制造很可能成为未来一个更大的基于高通量筛选和计算建模的自动化平台的一部分。

Figure 1．生物混合制造发展时间线及代表论文

1.1. 静电纺丝

溶液静电纺丝作为一种将带电荷的聚合物溶液拉伸成超细纤维的加工方法，无疑对组织工程与再生医学有着深远影响。静电纺丝收集到的结构类似于致密的纤维无纺布片，具有适于细胞穿透的低孔隙率，特别适用于组织工程。电纺结构的小孔隙解决了挤出式制造中细胞接种效率低的问题。溶液电纺丝在组织工程领域得到了广泛的应用，而熔融电纺丝通常会产生更大直径的纤维，这种尺寸差异在混合制造方法中常常被使用。Figure 2展示了部分基于静电纺丝技术与其他技术结合制造的混合结构。

Figure 2．基于静电纺丝的混合结构制造

1.2. 生物打印

将生物打印技术与其他制造技术相结合的先决条件是精确控制生物墨水的材料特性。当打印一个含有细胞的水凝胶数层之后，生物墨水上层的重量对下层施加了一个显著的力，结构会坍塌或变得不稳定。因此，一种更坚硬、挤出式的材料(通常是生物降解的热塑性聚合物，如PCL)被用来支撑生物墨水。熔融近场直写也被用于与生物医学应用的水凝胶复合，对这种软网络复合材料的大量研究已经证实，小直径、定位良好的纤维的小体积分数能够深刻地影响其力学性能。

1.3. 组织微球的生物组装

组织微球是密集排列的细胞聚集体，在生物制造和生物打印中使用组织球状体作为构建块的想法是在大约10年前提出的。利用组织微球作为生物制造的积木有许多优点:i)它们是三维的，在发育组织生物学和组织形成中观察到的自然缩合反应的复制中，组织微球具有最大的细胞密度；ii)具有适于生物处理的球状体；iii)它们具有通过自组装过程进行组织融合或形成更大尺寸组织工程构建的能力；iv)自组装/微球的形成与多种细胞类型有关，例如微球共培养以复制细胞的自然凝结生态位和细胞间的通讯；v) 组织微球的直径(通常在250±50µm，也到直径1毫米)可大量减少制造层数，因此可大量减少制造时间。目前微球已在几乎所有的组织类型有所应用。Figure 3列举了部分混合制造中采用微球进行细胞种植的研究结果。

Figure 3．基于微球的混合制造

1.4. 微针法

通过将球体穿在微针上将其定位成三维排列，微针的间距足以允许球体融合。文献表明组装过程中，微球的挤压变形并不会影响细胞活性或是ECM的产生与融合。利用该方法，选择合适的微球类型和位置，可以制备薄片、管道和非均质组织。虽然文献中微针法被描述为无需支撑，但实际是一种暂时支撑，起到了支架的功能，尤其适合混合制造方法。由于微针法允许组织结构的物理转移，组织可以在一定范围内持续融合与成熟。其他的增材制造方法（如双光子、近场直写、光固化等）可以与微针法相结合，扩大生产可行性。Figure 4列举了使用微针法进行组装的混合结构制造。

Figure 4．基于微针法的混合制造

1.5. 熔融近场直写（MEW）

熔融近场直写通过施加在喷嘴与接收基板间的电压来稳定低速下的射流，获得的纤维直径范围从800纳米到150微米。由于粘弹性流体的物理属性，传统电纺与挤出成型分别存在上下直径范围限制。从制造角度看，熔融近场直写本身可以被认为是电纺与挤出成型的混合制造技术。与生物打印不同的是，熔融近场直写是一种无细胞的结构制造技术，尽管在理论上，在电流体力学（EHD）打印中使用含细胞溶液可以实现这一功能。
熔融近场直写的另一大优点是纤维具有良好的落点可控性，熔融近场直写支架具有很高的孔隙率（普遍大于80%，可高达98%），这既允许细胞粘附，也允许支架内的细胞的自组织。不同的纤维排列可以使组成的结构具有特殊的力学性能，也可以作为一种加固凝胶基质的方法。Figure 5列举了部分近场直写与其他生物制造技术结合的例子。

Figure 5．基于熔融近场直写的混合制造

1.6. 体式生物打印
如Figure 6，体式生物打印通过投射一系列图像到一个旋转容器，以体积的方式进行成型。虽然毫米级的细胞结构的快速制造本身令人兴奋，但将体式生物打印技术与其他制造技术相结合的能力将进一步推动这项技术的发展。例如，我们可以预测，光固化树脂可以与其他AM技术混合使用，如MEW、SLA或2PP在体式生物打印之前或之后制造的构件。此外，在体式生物打印之前，可以用另一种方法对光固化树脂进行修改，从而在打印结构中创建离散的结构或梯度。

Figure 6．基于体式生物打印与其他制造技术结合的潜力

1.7. 活性生物砖——类器官制造

类器官是来源于干细胞的微组织，具有自然人体器官的某些形态和功能特征。与微球的不同在于，类器官通过自然生长分化形成，而微球通过细胞悬液进行人工组装而成。类器官形态不规则，无血管化，无间质和神经支配，但其内部组织结构与人体自然器官的组织形态极为相似。在混合生物制造技术的发展中，人的类器官比微球更先进，也更具有潜在吸引力。现代生物制造和微流体技术可以使类器官的血管化和神经支配成为可能，从而使它们在生理和形态上与人体组织器官更加相似。
以上几种技术的混合示例的总结如下表所述

技术1技术2优点缺点溶液电纺电喷低成本；易制造缺乏聚合物与溶剂选；混入随空气传播的粒子溶液电纺挤出式打印低成本；大体积与表面积；体外改良使用溶剂；聚合物所占体积分数高溶液电纺喷墨可控细胞沉积使用溶剂；需要电纺基底；孔隙小挤出式打印挤出式生物打印大体积聚合物所占体积分数高双光子聚合（2PP）微球毫米级的构件单元高成本；需要更高的接种效率挤出式打印微球可控分布；毫米级细胞构件单元打印机复杂；聚合物所占体积分数高熔融近场直写（MEW）微球低聚合物占比；可变设计制造时间久；需手动接种熔融近场直写挤出式生物打印低聚合物占比需要定制打印机熔融近场直写电纺最小的溶液电纺管加固层；直写层定向细胞需要定制打印机熔融电纺电喷将支架力学与释药水平解耦混入随空气传播的粒子；电喷的通风与安全需求

2. 混合制造技术的意义

在目前的组织工程中，混合制造技术有如下几个意义：

1) 混合的方法可以开发更多的仿生支架和组织结构；
2) 混合方法能够在不影响支架生物力学性能和生物相容性的情况下增加支架的孔隙率；
3) 混合生物制造可以增加初始细胞密度，从而节省细胞增殖和组织工程构建成熟所需的时间；
4) 基于人工和机器人的混合技术允许更精确地装配细胞和组织微球。

3. 混合制造技术的发展方向

1) 增加组织构建的可用体积
熔融近场直写可以构建增强结构的同时，保持低体积占比，这对构建具有高细胞相容性与大容量的结构是非常必要的。在这些结构中，细胞不可穿透部分仅占总体积的10%，目前可低至2%。另一方面，将构建的结构体积增加到人体组织所需的厘米级别是该领域的一个长期挑战。

2) 增加生物模拟支架和组织构建的复杂性

混合制造的策略实际上为不同技术的创造性组合提供了无限机会，以实现具有复杂结构的高度理想组织结构。紧密堆积的微球经组织融合后，其密度高于天然组织和器官。在某些组织中，这种高密度是细胞外基质开始有序合成和沉积的必要前提。因此，结合高填料细胞密度的组织微球有望提供大量的组织工程和再生医学需要的产物。反过来，血管化的策略也因维持营养而变得尤为重要。复杂血管系统的建立、趋化梯度、遗传性细胞密度、生物力学和模拟细胞外基质的分布是目前应用技术还远远不能与天然组织的精细复杂分布相匹配的一些领域。以前的混合制造研究已经触及到这一点，包括集成的组织器官打印机，它结合了熔体挤出和生物打印，用于制造各种带血管的肌肉骨骼组织。最近，生物打印过程中多材料转换的功能被实现，这可能进一步增加改变细胞密度和机械强化的分布的能力。虽然复制自然组织的复杂性似乎是目前的制造技术无法克服的，但改进的分辨率和新的制造技术及其与其他技术的结合可以提高在这方面的能力。

3) 更自动化、精确地放置细胞或微球

因为生物制造的核心是细胞/微球的多级放置，构造更类似体内环境的组织结构，所以可定制的释放与直写在这一层面非常重要。而实验的复杂性与结果的差异性要求过程的自动化，可重复的自动化细胞处理可以减少变异，最大限度提高效率，提高实验的质量与可重复性。生物制造与生物反应系统的集成也可在这一方面为组织成熟提供帮助。

4) 装配线和多功能生物制造打印机

自动化生物制造设备的设计与实现是另一大重要趋势，它为复杂组织结构的自动化、可扩展、标准化和具有成本效益的生物制造开辟了一条直接的道路，这对组织工程与再生医学产品的成功临床转化和商业化至关重要。目前主要有两种策略来混合多种制造技术，如Figure7：（1）使用一种多功能设备将一组不同的功能组合在一起；（2）将分离的单功能设备集成到一条生产线。