题目:A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223
circular RNA(HRCR)靶标结合miR-223保护心脏免受心肌肥厚和心脏衰竭
期刊:European Heart Journal
影响因子:15.064
研究方向:医口(心肌肥大、心脏衰竭)
研究手段:miRNA基因芯片分析
初筛结果:miRNA芯片分析筛选出一个在心肌肥厚和心脏衰竭过程中显著差异表达的miRNA(miR-223-5p)
实验处理
WT组:患有心肌肥厚和心脏衰竭的小鼠
ISO处理:在小鼠背侧植入带有异丙肾上腺素(ISO)的微型泵,对照组植入带有生理盐水的微型泵
TAC处理:通过手术人为产生主动脉弓缩窄,假手术组缝合线不打结
技术手段
qRT-PCR,RT-PCR,Northern bolt,Western blot,RNAhybrid分析,pull down assay,过表达,基因敲除,荧光原位杂交(FISH)等。、
研究结果
作者首先通过miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技术手段发现,ISO处理14天后,miRNA-223的表达量显著上调,并且在患有心脏肥厚和心脏衰竭的人和小鼠心脏中miRNA-223的表达量也有明显的上调,初步得出结论:miRNA-223参与调控心肌肥厚和心脏衰竭。接下来作者利用miR-223过表达转基因小鼠以及miR-223基因敲除转基因小鼠进一步验证表型,结果发现miR-223过表达小鼠成年后出现明显的心肌肥厚和心脏衰竭症状,而miR-223基因敲除小鼠表型相反,进一步证明在活体内,miR-223可以诱导心肌肥厚和心脏衰竭。
图1 miR-223调控心肌肥厚和心脏衰竭示意图
接下来作者进一步研究miR-223对心肌细胞的影响,结果发现miR-223过表达细胞中出现明显的心肌肥大反应,而miR-223敲除细胞中,ISO处理引起的心肌肥大反应明显被破坏,说明miR-223过表达会促进心肌肥厚,而miR-223基因敲除会阻断心肌肥厚。
图2 心肌细胞内miR-223诱导心肌肥厚反应
为了进一步研究miR-223调控心肌肥厚和心脏衰竭的分子机制,作者筛选了一些参与调控心肌肥厚的基因作为miR-223的靶标候选基因,然后通过western blot分析miR-223过表达和缺失突变体中上调以及下调的基因,结果发现miR-223可以显著抑制ARC的表达,而前人已经有研究报道ARC参与调控心肌肥厚和细胞凋亡,所以初步推断ARC可能是miR-223下游的靶标位点。
接下来作者通过RNAhybrid分析发现,ARC的3′UTR含有潜在的miR-223的结合位点,然后通过Target Protector technology进一步证明miR-223可以特异调控ARC的表达,ARC 3′UTR的翻译活性受到miR-223的抑制。
接下来作者构建了一个不带ARC 3′UTR的腺病毒载体,这种病毒载体对miR-223不敏感,结果发现这种腺病毒可以减弱ISO处理诱导的心肌肥厚反应。然后作者通过ARC过表达转基因株系进一步证明了ARC可以保护心脏免受心肌肥厚和心脏衰竭,减少细胞凋亡。以上这些研究结论表明:在调控心肌肥厚和心脏衰竭的过程中,ARC是miR-223的下游靶标位点。
图3 miR-223参与调控ARC的表达
CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一个热点话题,为了进一步研究是否有CircRNA参与调控miR-223的表达,作者从CircRNA数据库中随机筛选出100个CircRNA,通过qRT-PCR验证筛选到36个CircRNA,然后通过Northern blot筛选到一个特异性表达的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然后作者通过RNAhybrid分析发现HRCR包含6个CircRNA的靶标结合位点,初步表明HRCR可以和miR-223结合。接下来作者通过生物素标记、qRT-PCR、Northern bolt、pull down assay、荧光原位杂交(FISH)等技术手段,从正向以及反向两个角度分别验证HRCR和miR-223之间的互作关系,结果发现miR-223和HRCR在细胞质中存在共定位现象,HRCR可以直接结合到miR-223上。
图4 活体内miR-223可以结合心脏相关的CircRNA
HRCR和miR-223存在互作,而miR-223可以通过调控下游ARC的表达,进而调控心肌肥厚和心脏衰竭,为了进一步研究HRCR对ARC表达的影响,作者构建了HRCR过表达载体和基因敲除突变体,结果发现HRCR过表达载体中,ARC的表达量和活性显著增加,HRCR敲除突变体中,ARC的表达量和活性显著降低,并且HRCR可以消除miR-223对ARC表达的抑制作用,说明HRCR可以通过调控miR-223以及ARC的表达,进而调控心肌肥厚。
图5 HRCR通过调控miR-223以及ARC的表达进而调控心肌肥厚
最后,作者在动物模型中进一步验证HRCR对心脏肥厚和心脏衰竭的调控作用,结果发现过表达HRCR可以减弱由ISO处理引起的心肌肥厚反应,超声波心电图结果显示,过表达HRCR可以改善心脏功能,说明在活体内,HRCR可以抑制心脏肥厚和心脏衰竭。
图6 活体内HRCR调控心肌肥厚和心脏衰竭示意图
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