3蛋白wb_如何解决 WB 非特异条带及高背景？问题排查+案例解析

常有小伙伴抱怨：走过最长的路，就是 WB 实验的弯路。在上一期，我们的指南教大家如何应对常见的无条带或条带位置异常的问题。WB 实验时，还会遇到各种奇葩现象，比如非特异性条带和高背景，怎样才能获得背景干净的条带呢？这期我们继续来解疑。

非特异性条带，杂草丛生为哪般？

WB 显色后膜上有非特异条带或高背景是实验常见的问题，每一个实验细节可能会决定成败，例如抗体稀释液中 NaCl 成分和脱脂牛奶的比例就与非特异条带密切相关，下图的示例中，5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl 的体系下，非特异性条带更少。

利用 R&D Systems^® 兔抗人 PTP1B 亲和纯化多克隆抗体(货号 AF1366)对 WB 实验进行优化。每个样本裂解 1×10⁵ 个细胞，并溶于 SDS 胶缓冲液进行 SDS-PAGE 蛋白分离：人 HeLa 细胞(Lane1)、MCF-7(Lane2)和 TF-1(Lane3)。电泳后，蛋白转膜至 Immobilon-P 膜，并在下述条件下免疫印迹，曝光时间为 30s。A，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl；B，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl；C，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl。

除以上原因，其它与实验体系有关的原因及解决方法总结如下：

下面重点了解，与样品中目的蛋白特性有关的、需要考虑的因素：

比如目的蛋白表达水平低，为检测到目的条带，需要提高上样量，结果中易出现杂带。

◆ 以 PHD3 为例

其也被称为 Egl 9 homolog 3 (EGLN3)，是一种广泛表达的脯氨酰羟化酶，理论