赵钰岚等:人源血管紧张素转化酶-C结构域在毕赤酵母中的表达667
2结果与分析
2.1pPIC9K-ACE-C载体的构建与鉴定
重组质粒抽提,用Primer1/Primer2引物进行PCR鉴定,得到约2 kb的片段(图1),与目的基因大小 (1 915 bp) 相符,用限制性内切酶Eco RⅠ和NotⅠ进行双酶切,出现约9 kb和2 kb片段,与载体 (9.3 kb) 和目的基因 (1 915 bp) 条带大小相符,说明表达载体构建成功。重组质粒的测序结果(测序图略) 也与NCBI的RNA库中查得的序列相符,未发生碱基突变。
2.2酵母重组子的鉴定和筛选
毕赤酵母GS115为His?菌株,不能合成组氨酸,因此只有含HIS4基因的重组质粒整合入GS115后,与宿主进行互补,才能在不含组氨酸的培养基MD板上生长。SacⅠ线性化后的重组质粒转化GS115后,产生His+ Mut+重组子,挑取单克隆用GS115基因组上5′AOX1引物和3′AOX1引物进行PCR鉴定(图2),可见两条带,一条为目的基因约2.5 kb,另一条为AOX基因约2.2 kb,野生菌GS115扩增出一条带,为AOX基因,空载体对照扩增出一条大小约500 bp的带。为增加目的基因在酵母基因组中的拷贝数,提高表达量,对阳性重组子进行了2次电转,并用高浓度G418筛选高拷贝数转化子,最终获得能抗G418 3 mg/mL的酵母转化子。
2.3ACE-C结构域的诱导表达和鉴定
2.3.1甲醇浓度对蛋白表达量和酶活力变化的影响
本菌种为Mut+型,对甲醇的消耗能力较强。结
图1重组质粒的PCR鉴定与双酶切鉴定
Fig. 1 PCR amplication of ACE-C gene and restrication analysis of the expression vector pPIC9K-ACE-C. M: DNA marker; 1: pPIC9K-ACE-C/Eco RⅠ+NotⅠ; 2: PCR of ACE-C gene. 果如图3所示,甲醇浓度1.75%时,总蛋白量和酶活力都是最高的。
2.3.2pH条件对蛋白表达量和酶活力变化的影响
pH值降低会影响细胞的膜通透性,进而影响蛋白的分泌。结果如图4所示,不同pH值对酶活力的影响较大;酸性环境明显不利于ACE-C结构域的表达,在pH 5.5时,蛋白表达量和酶活力最高。
图2PCR鉴定毕赤酵母整合
Fig. 2 PCR analysis of recombinant strain. M: DNA marker; 1,2: the expression strain of pPIC9K; 3,4: wild strain; 5: the
expression strain of pPIC9K-ACE-C.
图3不同甲醇浓度诱导下的总蛋白和酶活力变化
Fig. 3 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation
supernatant induced by different concentration of methanol.
图4不同pH条件下甲醇诱导的总蛋白和酶活力变化Fig. 4 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant of different pH condition.