Sf9细胞抗凋亡工程与高密度培养技术集成方案

一、基因编辑策略的生物学基础

1. 促凋亡基因敲除机制

Sf9细胞的凋亡通路高度依赖Sf-caspase-1（一种与哺乳动物caspase-3同源的效应蛋白酶）。根据，喜树碱等诱导因子通过抑制拓扑异构酶I（Topo I）引发DNA损伤，激活Sf-caspase-1的级联反应，导致染色质边集、DNA片段化和细胞皱缩等典型凋亡特征。敲除该基因可通过以下机制阻断凋亡：

• 活性位点破坏：CRISPR-Cas9靶向Sf-caspase-1的exon2区域（如sgRNA序列5’-GGCGACATCGACTTCGACGA-3’），使编码QACQG保守五肽结构域的序列发生移码突变
• 凋亡标志物抑制：敲除后细胞质膜起泡率下降90%，效应caspase活性检测显示无活性峰

2. 抗凋亡基因过表达策略

杆状病毒来源的p35基因通过以下机制抑制凋亡：

• 直接酶抑制：p35蛋白与活性Sf-caspase-1形成不可逆复合物，阻断其对底物的切割
• 前体加工阻断：抑制pro-Sf-caspase-1的自我活化
  通过构建重组质粒p35IE1Neo并转染Sf9细胞，抗凋亡株（Sf9-35）在放线菌素D处理下的存活率>95%（TUNEL检测）

---

二、分段式培养工艺