摘 要:准确定量分析湖泊河流中浮游植物群落结构对评价湖泊河流健康和保障人类饮水安全至关重要. 显微镜镜检法是定量分析浮游植物群落结构的唯一方法,但不能满足浮游植物计数分析要求. 在Utermöhl倒置计数管视野法基础上提出倒置显微镜拍照法,使用拍照法对小球藻、四尾栅藻、斜生栅藻3种纯藻样品和鄱阳湖野外样品计数得到:1)在5、10倍物镜下拍照因浮游植物个体太小导致计数不准确,在20、40倍物镜下拍照计数准确,增加拍照次数可较好地避免计数偏差,拍照次数是影响拍照法计数分析的主要因素;2)小球藻、四尾栅藻、斜生栅藻在20和40倍物镜下分别拍摄5和10张照片时每升浮游植物计数稳定;鄱阳湖野外样品在20和40物镜倍下分别拍摄5、10张照片时每升浮游植物计数稳定;3)倒置显微镜拍照法比计数框行格法、目镜视野法、目镜行格法和Utermöhl倒置计数管视野法计数稳定,变异系数最小为0.812.
Abstract: Accurate and quantitativeanalysis of phytoplankton communities in lakes and rivers is very important toevaluate the health of lakes and rivers and ensure the safety of human drinkingwater. Microscopic examination is the only method for quantitative analysis ofphytoplankton community structure, but it can not meet the requirement ofphytoplankton count analysis. Based on the vision field method with an Utermöhl inverted counter, the method of using photograph taken by invertedmicroscope is put forward. This approach was used to count the three kinds ofpure algae samples and Poyang Lake field samples and we found that: 1) Thecount is not accurate with the magnification of 5 or 10 times because thephytoplankton is too small, but accurate for 20 or 40 times. The number ofphotos is the main factor affecting the counting and analysis of the photomethod, with higher accuracy for large numbers of photo-taken times. 2) For allthe samples, the counting results are stable when taking 5 or 10 photos withmagnifications of 20 or 40 times. 3) The method of inverted microscopephotograph is more stable than that of counting frame, eyepiece field of view,and Utermöhl inverted counter field of view, with a minimumcoefficient of variation of 0.812.
1 材料与方法
1.1样品采集
实验选用的浮游植物样品分为纯藻样品和野外样品,纯藻样品为实验室培养的四尾栅藻、斜生栅藻、小球藻3种纯藻,野外样品为鄱阳湖出湖口、主湖区和湖汊3种生境浮游植物样品. 野外浮游植物样品在水面与0.5 m深的水层之间使用柱状采水器采集,用网目孔径为4 μm的浮游植物网过滤5 L水样,并将浮游植物样品加1滴鲁格氏液保存在50 mL的样品瓶中,样品使用冷藏箱保存等待镜检. 野外样品须在水体透明度大于30 cm的水体采集,若透明度小于30 cm时,须将混后水样在10 L水桶中待泥沙沉降后再取混合水样,以避免泥沙对浮游植物镜检的影响.
1.2 样品镜检
计数框行格法采用长20 mm、宽20 mm、体积0.1 mL的计数框对浮游植物进行镜检,样品厚度约为250 μm,计数框横、竖各划分10行格,共100个小方格. 将计数样品充分摇匀,吸取0.1 mL到计数框中,对计数框上第2、5、8行共30个小方格(面积为120mm2)进行计数[18],在5、10、20和40倍下需观察视野数分别为15、30、97和392个.
倒置显微镜拍照法采用直径27.5 mm、面积593.6 mm2、体积5 mL的管状浮游浮游植物计数管对浮游植物进行镜检. 取0.5 mL样品置于计数管内,样品厚度约为842 μm,静置30 min,通过显微镜摄像头对浮游植物拍照. 倒置显微镜拍照法不需长时间沉淀和次级抽样步骤而直接计数,在5、10、20和40倍下对样品分别拍摄5、10、20和20张浮游植物照片,且40倍条件下至少拍摄每个样品中所含有种类数的照片量,即有多少种就需拍摄多少张照片,照片应均匀分布在计数管内.
1.3 计数公式
计数框行格法计数公式为:
式中,N为每升原水样中的浮游植物数量(个/L),Sk为计数框面积(mm2),Sj为计数面积(mm2),Vs为浓缩后水样的体积(mL),Va为取样镜检水样体积(计数框体积)(0.1 mL),n为计数所得浮游植物的数量,Vm为野外水样体积(mL).
倒置显微镜拍照法计数公式为:
式中,Ni为第i物种在1 L水样中的个体数量,Sg为计数管面积(mm2),Sj为计数照片面积(mm2),P为照片数.
2 结果与分析
2.1 计数框行格法计数
采用计数框行格法对纯藻样品和野外样品进行观察,样品在5倍下观察形状为两方格(图1),浮游植物个体太小,个数太多,无法计数;样品在10倍下观察形状为一个小方格(有少部分不在视野中),个体太小,个数太多,无法计数;样品在20倍下观察计数形状为圆形,小球藻个体偏小,个数太多,四尾栅藻、斜生栅藻个体清晰可见,计数准确,野外样品个体清晰可见,计数准确,但有些种类识别不出;样品在40倍下观察计数形状为圆形,纯藻样品和野外样品浮游植物清晰可见且计数准确.
图1 计数框行格法计数视野
Fig.1Counting field of view
小球藻在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物144个,在40倍下计数10个视野平均,每个视野浮游植物28个;四尾栅藻在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物74个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物13个;斜生栅藻在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物222个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物42个. 出湖口样品在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物6个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物2个;主湖区样品在20倍下计数5个视野平均每个视野浮游植物18个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物10个;湖汊样品在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物18个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物3个(表1).
表1 计数框行格法对浮游植物计数*
Tab.1 Counting phytoplankton by counting box row grid method
2.2 倒置显微镜拍照法计数
采用倒置显微镜拍照法对对纯藻样品和野外样品观察,样品在5、10、20、40倍下观察计数形状都为长方形即照片形状(图2);样品在5倍下观察计数个体太小,个数太多,无法计数;样品在10倍下观察计数个体太小,个数太多,估算计数;样品在20倍下观察计数,小球藻个体偏小,个数较多,四尾栅藻、斜生栅藻、野外样品个体清晰可见且计数准确;样品在40倍下观察计数,小球藻、四尾栅藻、斜生栅藻和野外样品藻体清晰可见且计数准确.
图2倒置显微镜拍照法计数照片
Fig.2 Counting photos with inverted microscope
小球藻在10倍下计数2张照片,平均每张照片浮游植物302个,在20倍下计数5张照片,平均每张照片浮游植物73个,在40倍下计数10张照片,平均每张照片浮游植物18个;四尾栅藻在10倍下计数2张照片,平均每个照片浮游植物102个,在20倍下计数5张照片,平均每张照片浮游植物27个,在40倍下计数10张照片,平均每张照片浮游植物7个;斜生栅藻在10倍下计数2张照片,平均每个照片浮游植物325个,在20倍下计数5张照片,平均每张照片浮游植物77个,在40倍下计数10张照片,平均每张照片浮游植物20个. 出湖口样品在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物2个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物0.5个;主湖区样品在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物10个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物2~3个;湖汊样品在20倍下计数5个视野,平均每个视野浮游植物13个,在40倍下计数10个视野,平均每个视野浮游植物3~4个(表2).
表2 倒置显微镜拍照法对浮游植物计数*
Tab.2 Counting phytoplankton with inverted microscope
2.3两种方法计数统计分析
采用计数框行格法和倒置显微镜拍照法对6种样品进行镜检计数数据分析. 结果表明,计数框行格法计数的变异系数都较大,变异系数最大的是四尾栅藻样品(25.980),变异系数最小的是出湖口样品(9.157);倒置显微镜拍照法计数的变异性都较小,变异系数最大的是出湖口样品(6.356),变异系数最小的是湖汊样品(0.812)(表3). 与计数框行格法相比,倒置显微镜拍照法变异系数较小,说明倒置显微镜拍照法在浮游植物计数时稳定,存在较少影响因素.
表3 两种方法变异系数
Tab.3 Coefficient of variation of two methods
3 讨论
3.1 影响浮游植物定量分析的因素
影响浮游植物定量分析的因素主要有采样、镜检和浮游植物种类等. ①因野外采样方法不同常导致浮游植物定量分析不准确,例如使用浮游植物网采样会使微小浮游植物丢失;使用浓缩法在浮游植物样品浓缩不同倍数时浮游植物损失各不相同,因实际操作时浓缩法存在很大的经验性,从而降低了不同来源数据之间的可比性[2];使用联合国教科文组织1978年编入浮游植物手册 (Phytoplankton Manual)[17]的Utermöhl法可较好地避免浮游植物采样影响,但在移除样品上清液时会导致浮游植物损失,且Utermöhl倒置计数管视野法最大的沉淀样品量为100 mL. ②浮游植物因镜检方法不同导致定量分析不准确,比如:计数框行格法、目镜视野法、目镜行格法、Utermöhl倒置计数管视野法等不同镜检方法在不同倍数条件下对定量分析的影响;因镜检使用不同容器及不同体积样品(如计数框0.1 mL和计数管1 mL)对定量分析的影响;因使用正置显微镜和倒置显微镜等不同显微镜及镜检不同人对定量分析的影响. 因此镜检方法选择是浮游植物定量分析的关键. ③浮游植物因种类不同而导致定量分析有差异. 不同门类植物的计数方式不同,例如盘星藻属、微囊藻属与裸藻属等计数方式不同,常导致定量分析不准确;不同浮游植物物种线性参数测量不同,浮游植物体积生物量计算模型构建不同. ④浮游植物定量分析从野外采样到数据分析,共经历3次重新抽样:第1次是野外采样调查;第2次是从样品取0.1~1 mL样品计数;第3次是从计数框或计数管中选择观察的视野面积. 3次重新抽样分析和“采样、镜检和种类参数”分析未形成操作标准程序,常导致浮游植物定量分析数据不准确,最终研究结论较难解释实际现象和科学问题.
3.2 镜检方法的比较分析
镜检方法有正置镜检法和Utermöhl倒置计数管视野法,其中正置镜检法又分为计数框行格法、目镜视野法和目镜行格法,以上4种镜检方法都是人工视野法,即研究人员通过眼睛在目镜中观察每个视野,记录每个视野下有多少个浮游植物. 计数框行格法、目镜视野法、目镜行格法、Utermöhl倒置计数管视野法和倒置显微镜拍照法这5种镜检方法的比较分析见表4,以上5种方法在5、10倍下因浮游植物个体太小、个数太多,无法计数;目镜视野法、Utermöhl倒置计数管视野法在20、40倍下观察计数形状都为圆形,即一个视野,20、40倍下视野直径分别为1200、600 μm,面积分别为1.23、0.306 mm2,计数与计数框行格法结果一样. 目镜行格法在20、40倍下观察计数形状为宽度150或100 μm、长度2 mm的长方形,计数面积小于20、40倍下一个视野面积,故没采用目镜行格法计数方法没.
表4 五种镜检方法的比较分析
Tab.4 Comparative analysis of fivemethods of microscopy
本研究提出倒置显微镜拍照法可以减少以上4种方法缺陷,实现计数稳定. 倒置显微镜拍照法是将显微镜下观察到的浮游植物拍照保存,镜检过程仅需按程序拍照,然后对浮游植物照片进行分析计数及种类识别,避免因镜检人专业水平等因素影响. 影响倒置显微镜拍照法定量分析主要因素是显微镜的摄像头像素和拍照照片数量,样品静置沉降时间长短对定量分析有一定影响,由于浮游植物的沉降与藻体本身的形态、大小和生理状态等都有密切的关系, 理论上沉降的时间越长越好,但实际工作往往都有时间的限制[13],倒置显微镜拍照法沉淀浮游植物样品为0.5 mL,样品厚度842 μm,故此法沉降的时间在30 min即可消除沉降时间对镜检的影响.
3.3 镜检视野数和个体计数分析镜检视野数和个体计数因浮游植物不同种类个体大小差异常导致定量分析不准确. 目前镜检法计数方式为:①计数100~500个视野,计数值至少在300个以上,先计数100个视野,如计数后数值太少,再增加100个视野,计数视野均匀分布在计算框上;②牛海玉等[7][yl1] 认为镜检时选择计数400个即可基本保证定量数据的稳定性;③王骥等[19][yl2] 认为视野在计数框中分布要满足均匀性和随机性,每次计数100个视野,每个样品计数两次取其平均值. 以上计数方法对浮游植物定量分析有较大不确定性,例如:计数值300个如何确定,盘星藻属与裸藻属计算个数方法不同;某些样品中浮游植物个数没有300个,又如何计数;“先计数100个视野”是在多少倍下计数没确定,不同藻类需在不同倍数下才能分清种类;在40倍条件下100个视野仅占计数框的8.1%,计数100个视野所用时间通常100~200 min,工作量太大. 镜检法计数常因研究人员不同,导致 “藻类计数、视野次数”等结果出现偏差,因此显微镜人工镜检对专业水平要求高[3]. 以上4种镜检方法并未对浮游植物分类及计数留下可重复分析的证据,常导致浮游植物定量分析不可重复计数.
3.4 倒置显微镜拍照法分析
倒置显微镜拍照法对四尾栅藻、斜生栅藻、小球藻和野外浮游植物样品进行拍照分析,拍照数量可依据浮游植物密度而增减,在20倍下镜检时,当每张照片浮游植物个数少于5个时,拍摄照片数不少于20张;当每张照片浮游植物个数为6~10个时,拍摄照片数不少于10张;当每张照片浮游植物个数为11~15个时,拍摄照片数不少于5张;当每张照片浮游植物个数大于15个时,需对水样进行稀释再观察,任何倍数下拍摄照片总面积不少于计数管面积的0.2%. 显微镜选择倒置LeicaDMI4000B显微镜,视野参数、照片参数、计数照片数见表5.
表5 倒置显微镜拍照法镜检参数
Tab.5 Microscopy parameters of inverted microscopy
倒置显微镜拍照法影响因素主要有显微镜摄像头和浮游植物种类对计数影响. 浮游植物不同种类因个体大小相差悬殊而影响镜检计数,主要影响在一张照片上包含藻类数量,例如小球藻、四尾栅藻属可在一张40倍照片上,但颗粒直链藻则需在20倍下观察,因此在多少倍物镜条件下镜检要依据不同浮游植物种类来确定,避免对每种浮游植物测量线性参数和计数的影响. 采用浮游植物个体数量来估算浮游植物丰度可以说是不够精确的,因为不同种的浮游植物细胞大小差别很大[6],因此倒置显微镜拍照法才能准确地对每种物种进行计数分析,在进行生物量计算前首先要确定不同种类浮游植物的细胞大小及其计数的个数,依据种的计数才能计算出属、门等个数.
4 结论
1)倒置显微镜拍照法是浮游植物镜检的最佳方法. 在20倍下拍摄20张照片,对20张照片进行照片图像分析,避免传统方法的人为因素干扰. 增加镜检样品数和拍照照片次数,可提高定量分析数据稳定性. 倒置显微镜拍照法减少人为镜检不专业因素,为浮游植物长期观测数据可靠性奠定基础.
2)倒置显微镜拍照法比计数框行格法、目镜视野法、目镜行格法、倒置显微镜计数法对浮游植物计数更加稳定. 建议国家标准将倒置显微镜拍照法列为国家标准,有利于统一浮游植物定量分析的稳定性、有利于建立浮游植物大数据中心和浮游植物自动识别鉴定分析系统,更加有利于湖泊河流生态健康评价.
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