南瓜子抑制5α还原酶_链霉菌偶氮还原酶的生化特性及其在偶氮染料废水环保脱色中的应用...

本文是HaoDong;TianyuanGuo等人于2019年8月23日在《International Journal of Biological Macromolecules》杂志上在线发表的一篇关于“Biochemical characterization of a novel azoreductase from Streptomyces sp.: Application in eco-friendly decolorization of azo dye wastewater”的研究性论文，链霉菌偶氮还原酶的生化特性及其在偶氮染料废水环保脱色中的应用。

本文亮点

鉴定具有最高序列同一性77.10%的新型偶氮还原酶(AzoRed2)

AzoRed2对pH变化，有机溶剂等具有良好的耐受性。

构建含有AzoRed2和BsGDH的有效全细胞生物催化剂。

在250 μM甲基红下，在120 min内脱色达99%。

正文

偶氮染料是目前应用最广泛的化学染料，主要用于纸张，皮革，化妆品和药品等多种天然或合成纤维的染色和印花。在特殊条件下，偶氮键首先被还原难以降解，它能分解产生20多种致癌芳香胺，活化后改变人体DNA结构，从而引起多种病变并诱发癌症，这引起了人们对环境污染和人类健康问题的极大关注。

近些年人们开始以各种方法来处理染料污染的废水，其中从环境和经济的角度出发，人们开始广泛关注降解偶氮染料的生物修复方法。

目前研究发现偶氮还原酶是自然界中降解偶氮染料的关键酶。本文研究来自链霉菌s27的新型偶氮还原酶(AzoRed2)的鉴定、表达和性质。本文 利用不同的偶氮还原酶对 AzoRed2 进行了系统发育树分析。如图 1 a所示， AzoRed2 显示了与I族 FMN 依赖的 NADH 偏好偶氮还原酶的氨基酸序列相似性。此外，多序列比对结果(图 1 b)显示， AzoRed2 具有高度保守的 FMN 结合区，但在 NAD ( P ) H 结合区与其他 FMN 依赖的 NADH 偏好性偶氮还原酶的相似性较低。这些结果表明， AzoRed2 可能是属于Ⅰ族的一种蛋白质。

图1：AzoRed2的生物信息学分析。

黄素单核苷酸(FMN)依赖和NAD(P)H偏好是偶氮还原酶分类的两个重要特征。用SDS处理AzoRed2蛋白溶液，以确定AzoRed2与FMN的结合形式。紫外可见光谱结果(图2)表明，在463-448 nm范围内出现光谱蓝移现象，这是由于FMN与凋亡蛋白之间的非共价键断裂所致。以NADH或NADPH为电子供体，表明AzoRed2催化-N=N-键的断裂，对甲基红的催化活性与I族偶氮还原酶几乎相同。结合系统发育树分析结果、辅酶特性及经济因素，我们选择NADH作为下步实验的电子供体。

图2：天然AzoRed2和变性AzoRed2的紫外-可见吸收光谱。

研究温度和pH值对酶活性和稳定性的影响。如图3a所示，AzoRed2在55℃时表现出最大活性。由热稳定性及结果表明，选择30℃作为反应温度，有利于更多的间歇反应。

由图3b显示AzoRed2的最佳pH值为5.0，具有工业废水处理的理想性能。pH稳定性结果如图3c所示，在pH≥6.0时，AzoRed2的残留活性稳定，可以看出AzoRed2对pH值变化具有良好的耐受性。对不同偶氮染料的酶活性，我们测试了它的底物特异性，图3d表明AzoRed2对甲基红的活性最高，对其他物质酶活性相对较低可能是因其分子量较大。

图3：纯化AzoRed2的表征。 

偶氮还原酶-n=n-键的还原裂解需要一个高且连续的电子供体池(图6)NADH和NADPH，为了解决价格的问题，进行了辅酶原位再生。本文引入了一种辅酶再生酶枯草芽孢杆菌1-脱氢酶(BsGDH)，根据软件预测的偶氮还原酶AzoRed2的核苷酸序列，构建AzoRed2和BsGDH的共表达质粒及共表达了重组质粒(图4)。其表达载体和宿主菌株分别是pet28a(+)和bl21(de3)，并在n末端带有6×his标记，诱导蛋白表达，用SDS-PAGE法检测AzoRed2和BsGDH的表达水平，见图5。

利用耦合酶系统的细胞裂解液上清液测定其偶氮还原酶活性和GDH活性。得出结果，BsGDH不是偶合酶系统中的限速酶，它可以实时实现NADH对偶氮染料的脱色，可以看出AzoRed2和BsGDH的高表达水平可能有助于偶氮染料废水的高效脱色。

图4：AzoRed2和BsGDH偶联重组质粒的构建

图5：AzoRed2和BsGDH共表达偶联体系的SDS-PAGE分析。1，细胞裂解物上清液；2，细胞裂解物沉淀；3，蛋白质标记物。

图6：甲基红降解图。

辅酶NAD(P)+的加入可以大大提高催化效率，提高底物转化率，结果如图7a所示，90 min内不添加NAD+时，脱色率较低。由图7b结果得出，我们选择10 mM葡萄糖作为去除甲基红的最佳浓度，以降低处理成本。结果表明，随着全细胞生物催化剂的剂量增加，脱色率显著增加(图7c)。当生物催化剂投加量大于5.0 mg/mL时，120 min内甲基红的脱色率均达到99%，表明其在不添加外源NAD+的情况下不增加生物催化剂的负载量。考虑到基质耐受性(图7d)，当甲基红浓度增加到250 μM时，脱色效率略有下降，但仍达到99.11%，未发生底物抑制，表明其具有较高的底物耐受性。

图7：全细胞生物催化剂对甲基红脱色的优化。

结论

本文用含有AzoRed2和BsGDH的全细胞生物催化剂降解了代表性偶氮染料甲基红。探究了AzoRed2对pH值变化、有机溶剂等具有良好的稳定性，可以在恶劣条件下稳定分解染料。在高底物浓度(250 μM)和不添加外源辅酶的条件下，120 min内甲基红的降解率高达99%。综上所述，发现了一种性能优良的偶氮还原酶AzoRed2，其在处理含偶氮染料的工业废水方面具有广阔的应用前景。

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排版/关莹