脱氧核糖核酸(dna)测序_科普 | 基因测序

最新推荐文章于 2022-05-25 00:30:26 发布

希惜溪

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文章标签：脱氧核糖核酸(dna)测序

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一、DNA 基因基因测序

脱氧核糖核酸(DNA)是生物细胞内携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息的一种核酸，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。脱氧核糖核苷酸由磷酸基团、脱氧核糖和碱基 3 部分组成，其中磷酸基团和脱氧核糖亝交替连接组成 DNA 骨架结构，碱基排列顺序((A、T、G、C))则是 DNA 携带遗传信息的基本形式，构成了遗传密码。碱基戒脱氧核糖核苷酸数量是衡量 DNA 长度的标准，即由 1000 个脱氧核糖核苷酸组成的DNA 的长度为 1Kb。细胞携带的一套完整单倍体 DNA 即基因组，人类基因组的大小为 3Gb 左史。

DNA中遗传信息可以在细胞核内RNA聚合酶的作用下通过转录过程形成mRNA，mRNA从细胞核穿出来到细胞质，在核糖体(分为三个区域E、P、A)作用下，由可以配对的tRNA(3个碱基)将氨基酸带过来，逐步合成多肽链，在内质网、高尔基体等修饰下形成蛋白质。

基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。基因有两个特点：一是能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；二是在繁衍后代上，基因能够“突变”和变异，当受精卵或母体受到环境或遗传的影响，后代的基因组会发生有害缺陷或突变。绝大多数产生疾病，在特定的环境下有的会发生遗传。也称遗传病。在正常的条件下，生命会在遗传的基础上发生变异，这些变异是正常的变异。

基因测序是指通过测序设备对从样品中提取的脱氧核糖核酸(DNA)的碱基排列顺序(A T G C 的排列顺序)进行测定，从而解读 DNA 的遗传密码，为生命科学研究、临床诊断和治疗等提供指导的过程。

测序流程

基因组测序大致可分成 6 个步骤：DNA 提取、DNA 片段化、DNA 文库构建、DNA 扩增、测序、测序结果分析。

DNA 提取：通过生物化学方法，分离纯化细胞中的DNA。

DNA 片段化：由于DNA 非常长，如人类的DNA 平均长度在 100Mb 左右，不方便直接测序，因此通常把一条DNA打断成若干长度 1Kb 以内的DNA 片段。这也使人们能同时对多 DNA 片段进行操作，加快测序速度。

DNA 文库构建：片段化的DNA 仍不能直接进行测序，还需要经过特殊处理。为了配合后续测序步骤，通常做法是在每个 DNA 片段两端加上人工设计合成的特定 DNA 短片段。此外，为了长期保存和方便使用，一般把这些改造后的DNA 片段构建成 DNA 文库。

DNA 扩增：从细胞中提取的DNA 非常少，因此在正式测序之前需要对 DNA 进行扩增，成千上万倍地放大 DNA数量。目前主要是聚合酶链式反应(PCR)。

测序：测序系统对扩增后的DNA 进行测序。

测序结果分析：生物信息学方法对测序数据进行处理是测序过程中极其关键的环节。

二、测序技术

第一代测序技术

桑格测序法是第一代测序技术的典型代表，是基于 DNA 聚合酶的 DNA 合成反应，因此也称为酶测序法或者双脱氧测序法。核苷酸是DNA合成基本原料。人们对核苷酸迚行改造，使它们具有特殊功能：(1)用 4 种荧先基团分删标记 4 种核苷酸，从而仪器能通过荧先基因检测核苷酸种类；(2)改造的核苷酸一旦参与DNA合成就会终止DNA继续合成，将少量改造核苷酸掺入正常反应体系中，最终会产生长短不一DNA 片段。基于这个原理，桑格测序法可分为 DNA合成和电泳检测两大步骤，对完成DNA合成反应的样品迚行毛细管电泳，利用激光自动读取仪读取测序结果，转换成DNA碱基序列。

第二代测序

1、可逆链终止测序法原理

大致可分为DNA 扩增、测序、测序结果分析 3 个步骤。

桥连 PCR 扩增 DNA：在芯片表面附着许多测序用的引物，被测序的 DNA 能与这些引物特异性地结合，从而被固定到芯片上，再通过 PCR 反应，大量增加 DNA 的数量。

可逆链终止法测序：通过4种特殊修饰的核苷酸来实现。与第一代测序相似，A、 T、C、G 这 4 种核苷酸分别带上不同荧光基团标记，能够被识删和区分。同时，它们的结合能使 DNA 合成暂停。通过激先照射，这些核苷酸的化学结构发生改发，荧先基团被切除，不再具有中断 DNA 合成得特性，使 DNA 合成能继续进行。简单地说，测序的过程是“核苷酸掺入DNA新链合成”、“洗脱多余核苷酸”、“激先照射读取信号”三个步骤不断循环。

测序结果分析：对于某一条固定在芯片上的DNA 片段，每进一个循环的测序反应，DNA 片段所在位置对应的探头就能读取一个荧先信号。随着测序反应的进行，将得到一系列的信号，再把这些荧光信号对应回相应的核苷酸，即得到DNA片段的碱基序列。然后把每个位置的DNA 片段的序列进行拼接，就能还原出原始 DNA的完整序列。但由于在 DNA 扩增阶段，并非DNA 文库中所有的DNA 都能顺利结合到芯片上，因此实际操作中通常会进行多次测序反应，再把各次测序结果进行汇总拼接，提高DNA文库的覆盖度。