缺氧协调胶质母细胞瘤内髓系细胞的空间分布

作者，Evil Genius

这两天太累了，每天都有人跳桥，太原开始了轰轰烈烈的护桥运动，甚至贴上了标识，跳桥罚款1000，太原的网友们都开始排队了，太原的桥都不够跳的。

就在2024年5月24日的凌晨，又跳了一位。

太原号召大家维护秩序，安抚家人，广播天天说让大家好好活着。

我也当了志愿者，参加了护桥运动，其实人都有落难的时候，我也有，我落难的时候公司不仅没帮助，还把我开除了，合作的文章我的名字都去掉了，生怕我威胁到公司的利益，很多医学生不仅不帮忙，还在网上骂我，被网爆，都诋毁，老家房子都卖了，都经历过了，我当时也有轻生的想法，但是熬过去，回头看的时候，也就那么回事，根本没什么。

当然了，也要承认，当时自己并没有好好工作，开除就开除，我也没话说。

再比比跟我一起的人，运来大家都认识，已经是新格元的总监了，英男可能听的少一点，他和他媳妇现在都是承启生物的总监，而我现在屁都不是，我就不信，再惨还能比得过我。

感谢一下兰卫，兰卫作为一家知名的检测公司，公司实力还是可以的，目前也在做单细胞空间组，请了很多的博士来下场做项目分析，这在其他公司几乎是不可能的。

这个世界大多数都是好人，大家都愿意让这个世界更好。

今日参考文章Hypoxia coordinates the spatial landscape of myeloid cells within glioblastoma to affect survival（Science Advances ,IF 14.957）。

髓系细胞在胶质母细胞瘤(GBM)中非常普遍，存在于表型和激活状态的频谱中。现在对影响GBM中不同骨髓细胞群定位和功能的肿瘤微环境(TME)决定因素的了解有限。利用单细胞和空间转录组方法识别和绘制人类GBM肿瘤微环境(TME)中的各种髓系population。研究结果表明，不同的髓系population在GBM TME中具有不同的可重复的区隔化模式，这是由组织缺氧、区域趋化因子信号传导以及不同的同型和异型细胞相互作用驱动的。随后研究发现GBM中特定的肿瘤亚区，基于已确定的髓细胞群的组成，这与患者的生存有关。

背景知识

• 髓系细胞(包括单核细胞、巨噬细胞和组织驻留小胶质细胞)是GBM的主要组成部分，占GBM肿瘤微环境(TME)中发现的所有细胞的30%至40%.
• 髓系细胞被认为在促进GBM进展和治疗耐药性中起主要作用，包括损害对放疗和免疫治疗的反应。
• 巨噬细胞被认为是GBM新治疗方法的有吸引力的靶点，临床前数据支持巨噬细胞调节的益处。
• GBM的空间异质性是由于肿瘤细胞向健康组织浸润程度的变化，以及GBM的标志性特征的出现，如缺氧诱导的坏死和微血管增殖，这些特征使其与低级别肿瘤区分。
• 进一步的空间异质性表现在同一肿瘤不同部位的特定肿瘤亚克隆的增殖以及宏观上的血流和组织灌注。因此，在GBM中存在确定的空间特征，这些特征可能会影响髓系细胞的异质性和细胞区隔化。
• 空间转录组分析GBM发现髓系细胞明显区隔化，相似表型的细胞聚集在一起(巨噬细胞表现出特别强的聚集行为)，不同表型的细胞分离。
• 髓系细胞的空间格局似乎受到几个假定因素的调节，包括细胞相互作用(与髓系细胞、肿瘤细胞和血管细胞)、区域趋化因子信号，以及主要是组织缺氧。低氧niche优先被免疫抑制性巨噬细胞和浸润性单核细胞占据。

1、GBM中存在的多种髓系细胞状态

Characterization of cell populations present in the GBM TME using IMC

2、髓系细胞群的丰度在不同的GBM区域有所不同

• 先前的研究报道，小胶质细胞和巨噬细胞分别优先出现在肿瘤的周围或肿瘤的核心
• 计算在组织学验证的肿瘤边缘和核心区域内七个髓系亚群和非髓系细胞的丰度，发现边缘的稳态小胶质细胞和小胶质样细胞数量显著增加，核心的中间和促炎细胞(TAMInt和TAM-Mac)数量增加。
• 基于相对髓细胞丰度的区域分层聚类进一步表明，边缘和核心区域包含不同的髓细胞区室
• 尽管TME可能有更广泛的特征促进小胶质细胞与肿瘤相关巨噬细胞的积累，但在驱动特定髓系亚群积累的区域可能存在更多特定的局部特征。

Spatial transcriptomics quality control metrics, pre-processing, and heatmap of top differentially expressed genes

3、Myeloid populations exist on a spectrum of differentiation and activation states in GBM

• 空间数据联合单细胞数据发现髓样细胞在GBM中存在一系列激活状态，其中髓样细胞向小胶质细胞或TAM的极化最为突出。
• 根据PAGA定义的分化途径绘制伪时间图表明，小胶质细胞标记物丢失，而激活标记物(VISTA、CD74、CD16和IBA1上调)丢失，并最终转变为以CD163和CD206上调为特征的免疫抑制表型。
• 这些分析表明内源性小胶质细胞可能分化为肿瘤相关的巨噬细胞，而这种分化的主要途径是通过促炎激活状态。
   

结果4、小胶质细胞和巨噬细胞在GBM中表现出保守的区隔化模式

• 在肿瘤的同一区域内存在多个不同的髓细胞群。这就提出了一个问题:髓细胞在GBM中的区隔化是随机的，还是髓细胞定位和功能存在确定性的细胞和环境驱动因素。
• 不同的髓系细胞群在TME中具有不同的分布，一些群体似乎聚集在特定的区域(如TAM-Supp)，另一些群体聚集得更松散(如TAM-Int)，而另一些群体在TME中分布得更均匀(如Mg-Ho)。
• 为了证明在TME中，髓细胞群是否倾向于靠近或远离其他细胞群，分析量化了观察到的髓细胞群之间的距离是否与细胞随机分布预测的距离有显著差异。结果表明，小胶质细胞(Mg-like、Mg-Ho和TAM-Mg)和巨噬细胞亚群(TAM-Mac和TAMSupp)具有明显的空间分布模式。具体来说，小胶质细胞和巨噬细胞群体似乎表现出空间分离的偏好，巨噬细胞群体相互关联，远离小胶质细胞，小胶质细胞与其他小胶质细胞富集，远离巨噬细胞。各种群自身空间富集程度最高。在一些细胞群(TAM-Cd68、TAM-Int和Mg-like)中，与其他细胞群的预期和观察距离之间的差异接近于零。这表明这些种群更接近于随机分布，在整个TME中分布更加随机和均匀。由于边缘和核心区域之间相互作用的总体模式大致相似，这表明即使在整个肿瘤中不同的细胞丰度和环境下，具有相似表型的髓系细胞在空间上相互关联的倾向仍然存在。为了评估空间相关的髓细胞群是否在GBM TME中相互作用，随后将每个区域的髓细胞表达为网络，其中每个细胞与六个最近的邻居连接。这一分析表明髓系细胞群与自身相互作用最显著，与表型相似的群体在一定程度上相互作用，而不与不同的population相互作用。这种行为模式在边缘和核心区域之间是相似的，这表明这种行为在整个肿瘤中是保守的。

通过测量每个population的聚类系数，研究了髓系细胞在空间上与同类细胞的关联趋势。聚类系数是一种描述网络特性的统计数据，高值表明population形成了紧密相连的cluster，低值表明该群体的细胞在TME中连接弱，聚类更松散。在这一初步分析中，所有的髓系群体都表现出相似的聚类倾向，核心的TAM-Cd68和TAM-Int群体的聚类性明显更高。这些聚类值表明，大多数髓系population在TME中形成小的、弱连接的cluster。由于更丰富的population可能纯粹是偶然聚集在一起，随后修正了区域间population丰度差异的聚类系数。这表明，几乎所有的细胞群都表现出比偶然预期更多的聚集性。值得注意的是，TAM-Supp细胞在边缘显示出明显更密集的聚集。在边缘和核心区之间，聚类模式是保守的。测量分类性(网络中种群与不同种群的同类种群相连接的趋势的描述性统计数据)同样表明，细胞对与同类种群的细胞相连接表现出微弱但积极的偏好，这在边缘和核心区域之间是相似的。总的来说，这些数据表明，不同的髓系细胞群在TME中分离并形成松散的同型cluster，这种分离的生物学驱动因素大多独立于肿瘤边缘或核心的更广泛位置。

Myeloid cells exhibit high homotypic and low heterotypic clustering behavior in GBM

结果5、在GBM TME中，髓系细胞群的定位受到肿瘤、神经胶质和血管相互作用的影响

• 髓系细胞在GBM TME中不是随机分布的。
• 绘制这些不同population的相对密度图显示了肿瘤和神经胶质细胞在核心和边缘肿瘤区域内的宏观区域化，以及髓系细胞群在被广泛划分为小胶质细胞和巨噬细胞群体时的区域化。在细胞水平定性地绘制细胞群图谱表明特定髓细胞亚群与神经胶质细胞、血管细胞和肿瘤细胞之间存在潜在关联。
• 为了量化发现不同髓系细胞群的不同环境，使用了Rao二次熵的局部测量。这测量了每个髓细胞和与其相互作用的细胞(非髓细胞和髓细胞)之间的表型多样性，with highly scoring cells interacting with several cells with heterogeneous phenotypes.
• 分析进一步表明，巨噬细胞在肿瘤的细胞异质性更强的区域形成cluster，与多种不同表型的非髓系细胞相互作用。
• 非髓细胞的局部细胞组织影响髓细胞定位的方式在整个肿瘤中是保守的，因此巨噬细胞优先聚集在肿瘤细胞密集和表型多样化的区域.
• 髓细胞与肿瘤、神经胶质细胞和血管细胞之间相互作用的量化表明，几乎所有髓细胞群体与核心肿瘤细胞的细胞相互作用比例都显著更高，与边缘神经胶质细胞的相互作用比例显著更高。虽然这表明髓细胞在边缘和核心位置有明显的肿瘤和神经胶质影响，但这些影响可能受到不同区域和病例中髓细胞、肿瘤和神经胶质细胞丰度的既定差异的影响。
• 可能表明髓细胞主动避免与肿瘤细胞相互作用，或者优先响应其他信号，这使得髓细胞与肿瘤的相互作用不像偶然预期的那样常见。
• TAM-Mac和TAM-Supp细胞表现出最大的避免(即倾向于比预期的更少的相互作用)与肿瘤细胞，特别是在核心。
• 髓细胞群体也避免与神经胶质细胞相互作用
• 总的来说，髓细胞与肿瘤和神经胶质细胞的相互作用比预期的偶然作用要少，在不同髓细胞群之间的相互作用程度大致相似。除了神经胶质细胞对核心区域髓定位的影响减少外，边缘和核心之间的观察结果也相似。这表明，特定髓系细胞体定位的差异并不是由避免(或偏好)与神经胶质细胞或肿瘤细胞的直接异型细胞间相互作用所强烈驱动的。因此，观察到的巨噬细胞与肿瘤细胞的共定位可能是由不依赖于细胞间相互作用的共同因素或组织信号驱动的。相比之下，TAM-Supp细胞与脉管系统有明显的群体特异性关联。

结果6、巨噬细胞优先定位于GBM中TME的缺氧区域

• 环境因素和生物生态位也可能影响髓系细胞的活动和定位。组织缺氧，常导致坏死，是GBM的典型特征。
• 在分析的区域内，缺氧替代标志物(GLUT1和pERK)分布不均匀，提示肿瘤内存在离散的缺氧生态位。
• 巨噬细胞优先定位于缺氧区域，而小胶质细胞通常位于相对正常的区域。
• GBM病理的另一个环境因素和特征是血脑屏障(BBB)的破坏，这与炎症和异常血管生成有关。
• 结果表明浸润性TAM-Supp细胞位于缺氧区域，因此缺氧可能是将它们从通常的血管和血管周围位置吸引过来的信号。

结果7、通过IMC在GBM中鉴定的髓系细胞群与通过单细胞RNA测序确定的髓系细胞群一致

• 验证髓系细胞在GBM TME中定位的环境驱动因素。
• 髓系细胞亚群在空间上排布显示了细胞群的区隔化，在细胞群密度最高的地方有明显的隔离。
• 分析空间上髓系细胞和其他细胞类型的关联性。
• 为了了解髓系定位的潜在驱动因素，将髓系细胞群的丰度与每个SPOT内生物过程的基因特征联系起来。TAM-Mac-Supp和Mono群体优先积聚在缺氧信号增加和代谢改变的区域，这与GLUT1基因(SLC2A1)表达有关。HIF1A在肿瘤周围表达增加，但不是在缺氧特征最高的地方。整个TME有不同程度的缺氧，正如之前报道的那样。相比之下，剩余的髓细胞群与干扰素-α、雄激素和凝血反应的特征呈正相关。促炎信号通路(干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和活性氧)也影响特定髓细胞亚群的定位。特定细胞因子信号通路的基因特征也与spot内髓系细胞丰度相关。对趋化因子基因重复这一分析表明，髓系细胞的特定亚群的定位也由不同的趋化因子组控制。对缺氧反应的髓系细胞群(TAM-Mac- supp和Mono)与CXCL8、CXCL2、CCL20和CXCL3相关，而TAM-Mg和TAM-Mac群体与CCL4、CCL4、CCL3L1和CCL4L2相关。相比之下，Mg-Ho和TAM-Int的定位仅与趋化因子的表达弱相关。总之，这些分析表明特定的髓细胞群在TME的缺氧生态位中积累，并表明空间可变的趋化因子和炎症信号在髓细胞区室化中的作用。

结果8、髓系细胞环境由ST spot内髓细胞群的不同模式定义

• GBM TME中存在特定的髓细胞生态位，其特征是共同的生物学过程(例如缺氧)，并且由具有相似表型的髓细胞群体占据。
• 如果细胞聚集在一起，那么它是具有相同或相似表型的细胞。评估这些环境在TME内的分布发现，它们组织成跨越几个相互连接的spot的更大区域，因此spot之间的连接比例由相同环境的spot之间的连接所主导。

结果9、非髓细胞成分对髓细胞环境的贡献

• 分析了非髓细胞成分(即来自非髓细胞的基因的贡献)如何在不同的髓细胞环境中变化，特别关注髓细胞群体之间无差异表达的基因。
• 神经祖细胞样肿瘤细胞可能通过抑制局部髓系细胞群募集来影响髓系定位。

结果10、特定髓系环境的转录组特征与疾病存活率降低相关

• 通过肿瘤环境线索指示的髓细胞群的空间调控区隔化有助于GBM期间的疾病轨迹。

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