多组学文献分享----微生物群失调、中性粒细胞招募和间皮细胞间充质转移促进结直肠癌腹膜转移

作者，Evil Genius

多组学是趋势，对于肿瘤研究而言，单细胞 + WES是最经济的多组学组合。

今天我们多组学分享文献，scRNA + WES + 16s rRNA + （伪）空间

知识积累

腹膜转移（PM）在结直肠癌（CRC）中很常见。

细胞系、类器官和体内模型的功能分析表明，微生态失调促进了炎症和肿瘤前中性粒细胞的募集，而恶性细胞和间皮细胞的间质转化破坏了基质结构，增加了癌症细胞的侵袭性。

结果1、CRC和PM的单细胞图谱

48个配对样本的scRNA-seq数据，包括原发性结直肠肿瘤（n = 12), 邻近健康结肠组织（n=12），PM（n=12），邻近健康腹膜组织（n=9），12名CRC-PM初治患者的肝转移（n=2）和邻近健康肝组织（n=1）。

单细胞亚群分析，大家学一学文章中对亚群定义的方法。

结果2、不同患者共享三种恶性program

NMF分析也是越来越多了。

从11名患者那里获得了这些肿瘤的全外显子组测序（WES）数据，揭示了各种推定的驱动突变。

基于WES和scRNA-seq数据推断的突变和CNVs构建了系统发育树，存在高比例的共享突变表明CRC腹膜和肝转移的传播相对较晚。

在大多数个体中，CRC表现出比PM更大的炎症特征，NFKBIA和CXCL2的表达证明了这一点，与CRC相反，PM在大多数个体的间充质状态下类似于细胞，这反映在COL3A1、COL1A1、COL1A2和SPP1等基因的高表达上。

使用共识非负矩阵因子分解（cNMF）推断了不同肿瘤恶性细胞中的复发表达程序。根据其前50个加权基因对每个程序进行了注释，分析是否有任何恶性细胞程序与肿瘤转移有关。

结果三、结直肠癌中性粒细胞富集与生态失调有关

与PM微环境相比，CRC微环境中的中性粒细胞显著富集。

与健康结肠组织相比，中性粒细胞在CRC微环境中显著富集，然而，与健康腹膜组织相比，中性粒细胞在PM微环境中明显减少。

通过细菌16S rRNA的靶向荧光原位杂交（FISH）成像，证实了与健康结肠组织相比，存在大量渗透CRC的细菌，梭杆菌属和拟杆菌属是CRC19中最主要的属。

基于这些发现，推断CRC肿瘤发生过程中粘膜免疫的重塑和肠道细菌的失调促进了相互作用，导致抗菌中性粒细胞的募集。

结果4、PM中性粒细胞耗竭是由于CXCL14的缺失

尽管受体-配体相互作用分析可以解释CRC与健康结肠组织中中性粒细胞的富集，但它并没有解决为什么PM与健康腹膜组织中的中性粒细胞减少的问题。

CRC中性粒细胞的富集可归因于由共生细菌浸润引发的炎症反应。另一方面，在健康的腹膜组织中，中性粒细胞被表达CXCL14的MSCs/ASCs招募；然而，在PM中，MSCs/ASCs缺失，这些招募的中性粒细胞缺失。

结果5、结直肠癌中的癌前中性粒细胞和PM中的抗肿瘤中性粒细胞

基因集变异分析（GSVA）和差异表达基因（DEG）分析显示，CRC主要富集在炎症相关的中性粒细胞亚群Neu-IL1B-2中，该亚群表现出趋化因子CCL3和CCL4以及经典促炎因子IL1B的高表达水平。相比之下，健康的腹膜组织主要富含与免疫系统激活、TRAIL信号传导和吞噬途径相关的亚群。

根据组织类型对中性粒细胞进行分类，以比较它们在不同组织中的功能。CRC中的中性粒细胞在与细菌反应和经典炎症IL4和IL13信号传导相关的途径中特异性富集。相比之下，健康腹膜组织中的中性粒细胞在与IFN信号传导和免疫系统相关的途径中特异性富集。

基于其功能和组织特异性富集，假设富含CRC的中性粒细胞具有原肿瘤表型，而相对于健康腹膜组织，富含PM的中性粒细胞核具有抗肿瘤表型。为了进一步探索中性粒细胞的异质性，评估了上游转录因子（TFs）的激活情况。正如预期的那样，健康腹膜组织和CRC之间的TF活化存在显著差异。

通过在中性粒细胞样dHL-60细胞和人源性中性粒细胞上进行体外和体内实验，分别研究NFKB1和STAT4对中性粒细胞的抗肿瘤和抗肿瘤功能的影响。

分析表明了两种中性粒细胞亚型分别独立表现出抑瘤和抗肿瘤功能的潜在机制。

小鼠实验也有力地证明了两种中性粒细胞亚群的抗肿瘤和抗肿瘤表型

通过功能分析和实验验证，发现招募到CRC的中性粒细胞具有抗肿瘤功能，而PMs中缺失的中性粒细胞核具有抗肿瘤作用。中性粒细胞的这种动态变化促进了CRC和PM的进展。

结果6、PM中的耦合间质转化

重点研究了程序22，与CRC相比，该程序在PM的恶性细胞中高度上调。该程序被确定为富含参与基质和细胞外基质组织的途径和基因的间充质程序，包括COL1A1、COL3A1和EFEMP1。

健康腹膜组织相比，PM中间皮细胞和恶性细胞之间的细胞通讯增加。

标志物MSLN和成纤维细胞标志物αSMA仅在PM中共表达，与健康腹膜相比，PM相关间皮细胞观察到明显的形态变化和去极化。

间充质相关基因，包括胶原蛋白家族和FN1，在PM内的间皮细胞中表现出优先表达。PMs中ATF2的激活与ERK-AP-1信号通路有关，该通路与调节细胞扩张有关。此外，高度激活的YAP-MAL信号通路相关的TF，如PM中的SRF、SMAD3和ELK4，可能调节细胞伸展。这两种机制可能有助于MMT过程中发生的形态变化。此外，GSVA表明，与健康腹膜组织相比，PM中胶原蛋白和ECM相关途径的富集更为优先。

恶性细胞中程序22的差异表达与成纤维细胞的重塑有关。PMs中的大量成纤维细胞来源于接受MMT的间皮细胞，MMT取代了通常在健康腹膜组织中招募中性粒细胞的MSC/ASCs。

结果7、抗间皮素抗体可以抑制结直肠癌的PM

为了研究癌症和间皮细胞间充质转化的相互诱导，使用人CRC细胞系（RKO）和永生化人间皮细胞系（MET-5A）进行了共培养实验。

恶性细胞和间皮细胞直接相互作用，导致它们共同转变为间充质状态并改变微环境，最终促进细胞增殖、侵袭和转移。

在与RKO细胞共培养后，用抗MSLN处理MET-5A细胞48小时。结果表明，抗MSLN治疗显著抑制了细胞的侵袭、相互作用和形态变化。

靶向MSLN可能是抑制结直肠癌PM的一种有前景的治疗策略。

最后我们来看看关键的分析方法

首先看WES

单细胞的质控

细胞注释

单细胞的CNV分析

NMF分析

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