文献分享----中国人群胰腺癌患者的致病性胚系变异

作者，Evil Genius

单细胞空间外显子，现在联系非常紧密了。

这里问大家一个问题，如果大家做过肿瘤研究的话，应该明白绝大部分的肿瘤是因为突变导致的，比如肺癌EGFR的L858R、KRAS的G12D等等，从基因组的角度看很少有CNV导致的肿瘤发生，那么通过单细胞CNV分析判断肿瘤细胞的合理性有多高呢?

大家做研究发文章，分析 + 思路非常重要，分析部分主要是代码分析数据，强调分析的合理性，思路则是要求我们针对课题研究提供解决方案，找到问题的关键所在，两者相辅相成，不能分开来看，所以代码分析数据不能只会照抄，要理解底层的逻辑，根据需要进行选择，为课题思路服务，至于分析思路和主要的经验判断，大多数人来说并不是第一个吃螃蟹的人，所有有很多前人的经验可以借鉴，这就是大家要多看相关文献的主要原因。

尤其多组学的分析思路，如何综合多个组学的分析结果，是放在当下我们需要研究的内容。

今日参考文献

知识积累

胰腺癌（PAAD）筛查可以显著降低癌症发病率和死亡率。

对于已知的致病性/可能致病性种系变异，中国患者与西方患者相比表现出重叠但不同的胚系突变模式，在已知的PAAD基因（包括BRCA1、BRCA2、ATM、CDKN2A和CHEK2）中突变率较低，而在CFTR、RAD51D、FANCA、ERCC2和GNAS中存在中国患者特有的不同突变。CFTR在杂合性缺失分析后成为首选候选基因。

胰腺癌（PAAD）是一种高度致命的癌症，全球发病率不断增加。一些研究已经描述了PAAD基因组异常的情况，并确定KRAS突变是最主要的体细胞突变，占至少78%的病例。

以前未表征的PAAD生殖系基因的鉴定可能导致对这种毁灭性癌症的机制见解和潜在治疗策略。

遗传因素在PAAD的发病机制中起着至关重要的作用。

以前的研究主要集中在已知的致病基因，包括BRCA1、BRCA2、ATM、PALB2、CDKN2A、MLH1、MSH2、STK11和TP53。

通过测序匹配的肿瘤和正常样品获得的变异等位基因频率（VAF）可以验证肿瘤抑制基因的种系变异是否倾向于杂合性丢失（LOH），基因表达分析可以确认生殖系截短突变是否导致表达降低。

结果1、中国PAAD患者P/LP/VUS_D基因突变谱的研究

利用NGS研究基因组突变：（1）108对肿瘤-正常散装样品的全基因组测序（WGS）;和（2）281对样品的全外显子组测序（WES），共有389例患者纳入发现队列（表示为CH队列），（3）665例肿瘤正常样本的靶向测序作为验证队列;（4）69例类器官配对血液样本的WGS作为功能验证队列。我们通过与中国参考队列（n = 853）的对照组进行比较分析来确定全基因组生殖系突变，在CH队列中共检测到6423173个SNV和145652个indel。

根据基于ClinVar 和InterVar 的内部pipeline，在这些变异中，1616种被认为是致病性（P）或可能致病性（LP）。在200229种VUS变异中，预计有6791种有害的VUS（VUS_D）。在150个癌症易感基因（CSG）中，48个突变基因（在至少两名患者中发现）与遗传性胰腺癌风险有关，包括与遗传性胰腺炎有关的基因（CFTR、CASR、CPB1和CTRC），同源重组修复检测123例患者的BRCA1、BRCA2、PALB2、NBN、BARD1和RAD51D通路及DNA错配修复（MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MSH4、MLH3和PMS 1）通路。

CH队列中最常突变的基因是CFTR（3.6%），BRCA 1（1.8%），MSH2（1.8%），BRCA2（1.5%），MSH3（1.5%），MSH6（1.3%），PALB 2（1.3%），TSC 2（1.3%），EPCAM（1.0%），FANCA（1.0%）和GNAS (1.0%) 。BRCA1、BRCA2和ATM的有害基因型中约有86.3%为singleton，其中BRCA1的P68L突变频率最高。

Sanger测序验证了100%（7/7）的种系突变临床上，具有至少一个具有癌症史的一级或二级亲属的PAAD患者的比例在有害变体携带者中显著高于非携带者（27.6% vs. 15.7%，P = 0.002），这表明有害的癌症易感变异体可能使个体易患PAAD，并导致熟悉的clustering。此外，有其他癌症史的PAAD患者的比例（既往恶性肿瘤史）在有害变异携带者中高于非携带者（10.5% vs. 4.6%，P = 0.015），表明有害生殖系变异的存在也可能增加其他癌症的发病率（最常见于肺癌、肝癌、胃食管癌和结肠直肠癌）。

结果2、亚洲和西方PAAD之间众所周知的胚系P/LP图谱。

胚系突变在西方队列中比在亚洲队列中显著更常见。

生活在西方国家的亚洲人与其他亚洲人相比，表现出更高的BRCA 1和BRCA 2胚系突变频率。

仅在亚洲患者中鉴定了CFTR、RAD51D、FANCA、ERCC2和GNAS五个基因的突变。

结果3、Germline mutation and LOH events

为了研究生殖细胞和体细胞突变谱之间的相互作用，并发现与PAAD相关的潜在基因，对458例PAAD患者的配对正常和肿瘤样本进行了LOH分析。26个肿瘤相关基因中野生型等位基因的LOH为7.6%。BRCA 1和BRCA 2基因分别有2/7（29%）和1/7（14%）存在LOH，其他表现出LOH变异的基因包括：MSH2、MSH3和MSH6，它们都是识别DNA损伤的错配修复起始因子（4/21，19%）; PAL 2、ERCC 2和NBN，已知通过双链断裂激活的基因（11人中的4人，36%）; FAT1和FH，转录抑制因子参与BRCA1介导的细胞生长抑制WRN也是一个很可能的LOH缺失的候选基因。总共有34个变异显示出显著的LOH缺失。值得注意的是，CFTR是一个首选的候选基因，因为检测到了5个LOH缺失事件（5/18，28%）的CFTR涉及p.P140S、p.R279Q、p.E681V、p.C1355Y和p.S1456R。

结果4、CFTR VUS_D变异的功能确认

pipeline共将6791个变异分类为VUS_D。

除膀胱尿路上皮癌外，在所有癌症中均发现有害CFTR变异的患者，特别是CFTR p.E681V。

结果5、CFTR作为PAAD的融合遗传和表观遗传驱动因素

与匹配的正常样本相比，CFTR在发现队列肿瘤样本和公共肿瘤样本中均表现出较低的表达。

分析表明CFTR低表达与不良预后之间的关联。

CFTR在没有胚系突变的肿瘤亚组中下调，这表明其他机制也可能有助于PAAD中CFTR表达的降低，强调了CFTR表达的功能相关性。总之，遗传学和表观遗传学数据的融合强烈支持CFTR具有肿瘤抑制基因的特征。

结果6、CFTR是PAAD的一个抑癌基因

CFTR基因编码的膜支架蛋白在脊椎动物中形成阴离子通道，最近的研究表明CFTR种系突变与胰腺炎和胰腺癌相关。

CFTR突变体（p.L88X和p.C1355Y）几乎完全消除了肿瘤抑制作用。

野生型CFTR通常定位于细胞膜，然而，对于某些CFTR突变体，（p.C1355Y），尽管观察到蛋白质表达，但该蛋白质未能正确定位于细胞膜。与野生型CFTR（OE）相比，在CFTR p.C1355Y PANC-1细胞中检测到较少的膜CFTR表达。

CFTR突变可能影响细胞中的脂肪酸代谢或组成。

结果7、致病性胚系突变的药物筛选

为了确定PAAD中的生殖系突变是否与药物反应改变相关，我们使用患者来源的3D类器官（PDO）培养物进行了药物敏感性筛选，并估计了药物敏感性与类器官基因组特征之间的相关性。

最后来看看call 变异的方法

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