DNA琼脂糖凝胶电泳

干货：一文读懂琼脂糖凝胶电泳实验 - 哔哩哔哩 (bilibili.com)

简介

DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的实验技术，用于分离和分析不同大小的DNA分子。通过将DNA样品置于琼脂糖凝胶中并施加电场，DNA分子会根据其大小（分子量）在凝胶中迁移不同距离。小分子的DNA迁移得更远，而大分子的DNA则迁移得较近。

#蛋白质-聚丙烯酰胺凝胶

RNA往往会形成二级结构，而且有时同一个片段会有多个不同的种类，这会影响其迁移的方式-替代方法包括RNA印迹法和变性琼脂糖凝胶电泳

### 实验步骤

1. **准备材料和设备**
   - 琼脂糖粉
   - 电泳缓冲液（如TAE或TBE缓冲液）
   - DNA样品
   - DNA上样缓冲液（含染料）
   - DNA梯度（标准分子量标记）？
   - 电泳槽和电泳电源
   - 微波炉或热板
   - 模具和梳子
   - 紫外灯或其他DNA染色检测设备
   - 溴化乙锭（EtBr）或GelRed（用于染色）

2. **制备琼脂糖凝胶**
   - 称取适量琼脂糖粉，一般为0.5-2%的浓度（根据需要分离的DNA大小选择）。-琼脂糖的百分比越高，孔径越小
   - 将琼脂糖粉加入适量的电泳缓冲液（按需）中，混合均匀。

      ——三乙酰-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）或三硼酸-EDTA（TBE）[5]通常是首选的缓冲液，因为三酸溶液是微碱性条件下的有效缓冲液，可保持DNA去质子化并溶于水。EDTA是一种螯合剂，能使可能损害被分析的DNA的核酸酶失活。

   - 使用微波炉或热板加热混合物至琼脂糖完全溶解，呈现澄清状态。

   - 在模具的底部加入DNA夹层染料，如果使用的是EtBr，通常浓度为0.2-0.5 µg/ml。EtBr是一种诱变剂的证据目前仍有争议，-替代品[6]，如GBCBIO 
   - 将溶解的琼脂糖溶液冷却至约60°C左右，然后倒入预先准备好的模具中，插入梳子，形成样品槽。
   - 等待凝胶完全固化（通常需要20-30分钟）。

3. **准备样品和梯度**

   -将样品/marker与加载染料混合
   - 将DNA样品与上样缓冲液按比例混合（通常为1:1）。
   - 准备好DNA梯度，用于对照DNA片段的大小。

4. **装载样品**
   - 将固化的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，并加入电泳缓冲液至完全覆盖凝胶。
   - 小心地取出梳子，形成样品槽。
   - 使用移液器将DNA样品和DNA梯度分别加到样品槽中。

5. **进行电泳**
   - 将电泳槽连接到电泳电源，设置适当的电压（通常为80-120V）。
   - 开始电泳，通常进行30分钟至1小时，直到染料迁移至凝胶的1/2至3/4处。

6. **染色和观察**
   - 电泳结束后，将凝胶小心取出，放入含有染料（如溴化乙锭或GelRed）的染色槽中，染色15-30分钟。
   - 用去离子水或电泳缓冲液进行脱色，去除多余的染料。
   - 使用紫外灯或其他适当的检测设备观察染色后的DNA条带。

### 注意事项

- 使用溴化乙锭时要小心，因其具有致癌性，应佩戴手套和护目镜并在通风橱中操作。
- 样品上样时要小心，避免气泡和样品溢出。
- 控制好电泳时间和电压，以防止DNA样品跑出凝胶。

好的，接下来我会详细介绍上样缓冲液和电泳缓冲液的组成及其作用。

### 上样缓冲液（Loading Buffer）

上样缓冲液是用于在将DNA样品加载到凝胶之前与样品混合的溶液。其主要功能包括增加样品的密度，使其沉入样品槽底部，并提供可视化的染料以监测电泳过程中的样品迁移情况。上样缓冲液的典型组成如下：

1. **甘油或蔗糖**（50%甘油或40%蔗糖）：增加样品密度，使其沉入凝胶槽底部。
2. **染料**：帮助跟踪电泳过程中的样品迁移。常用的染料包括：
   - **溴酚蓝（Bromophenol Blue）**：通常用于跟踪较小的DNA片段（约300 bp）。
   - **二甲酚橙（Xylene Cyanol FF）**：用于跟踪较大的DNA片段（约4000 bp）。
   - **橙G（Orange G）**：用于跟踪非常小的DNA片段（约50 bp）。
3. **Tris-HCl**：保持样品的pH稳定，通常为10 mM。
4. **EDTA**：螯合金属离子，防止DNA降解，通常为1 mM。

一个典型的上样缓冲液配方如下：

- 50% 甘油
- 10 mM Tris-HCl（pH 7.6）
- 1 mM EDTA
- 0.025% 溴酚蓝
- 0.025% 二甲酚橙

### 电泳缓冲液（Electrophoresis Buffer）

电泳缓冲液用于在电泳过程中保持稳定的pH值并提供离子环境，以便DNA分子在电场中有效迁移。常用的电泳缓冲液有TAE和TBE两种。

#### 1. TAE缓冲液（Tris-Acetate-EDTA Buffer）

TAE缓冲液通常用于分离大于4 kb的DNA片段，具有较低的缓冲容量，但适用于长时间电泳。典型配方为：

- 40 mM Tris
- 20 mM 醋酸（Acetate）
- 1 mM EDTA

制备方法（1X工作液）：

- 242 g Tris碱
- 57.1 mL 冰醋酸
- 100 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）
- 加蒸馏水至1 L

#### 2. TBE缓冲液（Tris-Borate-EDTA Buffer）

TBE缓冲液适用于分离小于1 kb的DNA片段，具有较高的缓冲容量和更好的分辨率，但在长时间电泳时可能会导致凝胶过热。典型配方为：

- 89 mM Tris
- 89 mM 硼酸（Boric Acid）
- 2 mM EDTA

制备方法（1X工作液）：

- 108 g Tris碱
- 55 g 硼酸
- 40 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）
- 加蒸馏水至1 L

### 使用方法

1. **上样缓冲液**：
   - 将DNA样品与上样缓冲液按1:1或其他适当比例混合。
   - 使用移液器将混合物小心加到凝胶的样品槽中。

2. **电泳缓冲液**：
   - 根据实验需要选择适当的电泳缓冲液（TAE或TBE）。
   - 将预制好的电泳缓冲液倒入电泳槽中，直至完全覆盖凝胶。
   - 在电泳过程中定期检查缓冲液的水平，以确保其覆盖凝胶。

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