《生物信息学：导论与方法》----新一代测序NGS：重测序的回帖和变异鉴定----听课笔记（十）

第五章  新一代测序

5.7 3730 Sanger测序介绍

• Sanger测序法是经典的第一代DNA测序法，它的特点是操作简单，读长长，但是通量较低。
• 在一个Sanger测序反应体系中，包括DNA片断，脱氧三磷酸核苷酸(dNTP), 双脱氧三磷酸(ddNTP),测序引物及DNA聚合酶等。
• 测序反应的核心就是其使用的双脱氧三磷酸核苷酸由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可以用来中止DNA链的延伸。通过这样的设置，在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止，并形成不同长度的DNA片断；这些片断随后可被凝胶电泳分开并显示出来。

5.8 学生课堂报告

• 文献分享：How to map billions of short reads onto genomes
• 2009年发表在Nature Computational Biology上
• 主要内容：如何取对新一代测序技术得到的short reads来进行根据reference genome的对比。
• 二代测序技术，肯定要基于一些平台，第一种是罗氏的454平台，主要是基于磁珠法和焦磷酸测序进行的一种测序反应；第二种是比较常用的illumina solexa的平台，基于桥式PCR再加上可逆的终止反应来进行的一些边合成边测序的方法。
• 现在比较新的一代技术是单分子测序，它没有这两种方法的那种合成的捕捉，所以减少了聚合酶在合成的过程中引入的错误。
• 一般在PCR的过程中，聚合酶会引入一些错误，甚至还会有一些PCR的偏好性。
• 这篇文献讨论的Scientific Question:

1. Short sequence fragments produced by next-generation sequencing platforms are quite large.
2. Mapping the vast quantities of data is a challenge.
3. 'read mapping' problem
4. What programs are avaliable and how do they work?

• Alignment Programs

1. Traditional alignment algorithems: BLAST; BLAT
2. New generation alignment programs: ELAND program from Illumina(in charge)
3. Third-party software packages: bowtie; Maq  and so on(free)

• Limitations and Open Problem

1. Will the short-read mapping programs scale well as the reads get longer?
2. How should a program's parameters be adjusted, and can that adjustment happen automatically?
3. How useful is mapping quality in downstream analysis, and should it be computed while aligning reads as Maq does or later?