Phytobiomes Journal综述——柑橘微生物组:从结构和功能到微生物组工程

The Citrus Microbiome: From Structure and Function to Microbiome Engineering and Beyond

摘要

个体微生物通常与宿主有明确的关系，包括有益的、共生的和致病的相互作用。然而，在群落水平上，植物微生物组被认为在保护植物免受潜在病原体的侵害、获取营养以及促进生长和生产方面发挥着有益的作用。柑橘是全球重要的多年生水果作物，其生产面临诸多挑战。人们对柑橘微生物组的结构和功能的探索以及柑橘微生物组的工程设计有着极大的兴趣，以应对各种挑战。本文综述了近年来对柑橘微生物组的研究进展，包括根际、根际、根际和核心成员微生物组的组成和功能，以及它们的功能特征。我们将柑橘根相关微生物组与其他植物根相关微生物组进行了比较。我们也提出了一个观点，如何传入的病原体相互作用与居民微生物群落和他们的结果。尽管柑橘微生物群在对抗疾病方面具有很大的潜力，但利用柑橘微生物群进行有益的应用仍处于起步阶段。我们预计，高通量测序和多组学技术、人工智能、微生物联盟、基因组编辑技术和高通量培养的快速发展为柑橘微生物组研究和微生物工程提供了许多令人兴奋的机会，以改善柑橘的健康和生产力。

介绍

植物微生物组由不同的微生物组成，包括细菌、真菌、原生生物、古细菌和病毒，它们生活在宿主植物的外部或内部。生活在寄主植物外的微生物要么是附生的(即生活在植物组织表面)，要么是根际的(即生活在土壤中离根几毫米远的地方)。

相反，在寄主植物内部定植的微生物被称为内生微生物。个体微生物与其植物宿主的关系分为有益的、共生的和致病的。然而，在群落水平上，植物微生物组被认为发挥了有益的作用，保护植物免受潜在病原体的侵害，同时改善生长、健康和生产，并赋予植物适应性优势。植物根系类似于动物肠道，吸收营养和水分，并与微生物建立密切的相互作用。根微生物组(与根相关的根际、根际和内生微生物)(图1)是植物微生物组研究的一个重点，具有许多关键功能，包括协助养分吸收，通过产生植物激素促进植物生长，循环碳和养分，维持土壤特性，保护宿主免受病原体的侵害(例如，诱导免疫和生态位占领)。植物微生物组研究的另一个重点是叶际(即植物的地上部分)微生物组。叶片作为负责光合作用的植物器官，是仅次于根系的第二大植物微生物栖息地，是叶际研究的热点。另一方面，花和水果往往是重要的消费终端产品和许多病原体的入口点，因此，从研究和经济角度来看，这也是值得关注的。

柑橘是世界上最重要的多年生水果作物之一。然而，柑橘生产面临着许多挑战，包括营养限制和病害。在了解柑橘微生物组的组成和功能以及设计柑橘微生物组以应对柑橘栽培中的各种挑战方面，已经进行了大量的研究工作。随着近年来多组学技术的快速发展，如基于扩增子的测序、鸟枪宏基因组学、宏转录组学和代谢组学，植物微生物组的结构和功能越来越清楚地被阐明。本文综述了近年来柑橘微生物组的研究进展，包括柑橘地上和地下微生物组的组成、柑橘微生物组的核心分类和功能特征、柑橘根相关微生物组与其他植物根相关微生物组的比较、病害对柑橘根相关微生物组的影响以及柑橘微生物组操纵或工程改造的潜力和应用。

根际微生物

根际，定义为根周围的区域(图1)，是一个高度复杂的系统，控制养分动员，提高植物生产力，并帮助植物抵抗生物和非生物胁迫。在根际，根分泌物作为信号分子和食物来源，选择性地从散装土壤中招募微生物。根际微生物群的多样性和结构随着植物发育和健康阶段、基因型和土壤条件的变化而变化。根际微生物之间的相互作用是动态的，植物根系分泌的代谢物的波动有助于形成根微生物群。几项研究调查了柑橘根际微生物组与普通土壤的组成，但很少有人阐明根际定植的分子特征(表1)。

图1所示。柑橘微生物组的区室，包括叶际(植物的地上部分)、根际(植物根周围的区域)、根面(根-土壤界面)和内生(内部区室)(经过许可，改编自Shutterstock.com)。

表1 柑橘微生物组不同部位的主要发现摘要
部分	主要发现	文献
根际	确定了全球柑橘根际微生物群的优势分类群和核心分类群及其功能性状	The structure and function of the global citrus rhizosphere microbiome
	黄龙病(HLB)对柑橘根际微生物组的影响已经得到证实	Penicillin trunk injection affects bacterial community structure in citrus trees、Huanglongbing, a systemic disease, restructures the bacterial community associated with citrus roots、Huanglongbing alters the structure and functional diversity of microbial communities associated with citrus rhizosphere、Huanglongbing impairs the rhizosphere-to-rhizoplane enrichment process of the citrus root-associated microbiome.
	从柑橘根际中发现了几种线虫	Geospatial patterns of soil properties and the biological control potential of entomopathogenic nematodes in Florida citrus groves.、Plant parasitic nematodes fauna in citrus orchards in Khuzestan province、Tylenchulus semipenetrans alters the microbial community in the citrus rhizosphere、Nematophagous fungi associated with Tylenchulus semipenetrans and the citrus rhizosphere
根表	多个细菌属及其功能性状表现出较强的根际到根面富集模式，受HLB的影响	Huanglongbing impairs the rhizosphere-to-rhizoplane enrichment process of the citrus root-associated microbiome.、Mechanisms underlying the rhizosphere-to-rhizoplane enrichment of Cellvibrio unveiled by genomecentric metagenomics and metatranscriptomics
	已经发现了多种潜在的柑橘有益微生物	An in vitro pipeline for screening and selection of citrus-associated microbiota with potential anti-”Candidatus Liberibacter asiaticus” properties、Characterization of antimicrobial-producing beneficial bacteria isolated from huanglongbing escape citrus trees、Induced systemic resistance against citrus canker disease by rhizobacteria.、Mechanisms underlying the rhizosphere-to-rhizoplane enrichment of Cellvibrio unveiled by genomecentric metagenomics and metatranscriptomics
根内	鉴定了柑橘内源性微生物群的优势门和有益菌群;HLB对内啡肽微生物群有深远的影响	Penicillin trunk injection affects bacterial community structure in citrus trees、Deciphering bacterial community variation during soil and leaf treatments with biologicals and biofertilizers to control huanglongbing in citrus trees、Defining the core citrus leaf- and root-associated microbiota: Factors associated with community structure and implications for managing huanglongbing (citrus greening) disease、Disease-induced microbial shifts in citrus indicate microbiome-derived responses to huanglongbing across the disease severity spectrum.、Studies of microbiota dynamics reveals association of “Candidatus Liberibacter Asiaticus” infection with citrus (Citrus sinensis) decline in south of Iran、Huanglongbing, a systemic disease, restructures the bacterial community associated with citrus roots.、Huanglongbing alters the structure and functional diversity of microbial communities associated with citrus rhizosphere
叶际	结果表明，不同地理位置、不同品种、不同健康状况的柑桔叶圈中优势门的比例存在显著差异	Deciphering bacterial community variation during soil and leaf treatments with biologicals and biofertilizers to control huanglongbing in citrus trees.、Defining the core citrus leaf- and root-associated microbiota: Factors associated with community structure and implications for managing huanglongbing (citrus greening) disease、Disease-induced microbial shifts in citrus indicate microbiome-derived responses to huanglongbing across the disease severity spectrum.、Studies of microbiota dynamics reveals association of “Candidatus Liberibacter Asiaticus” infection with citrus (Citrus sinensis) decline in south of Iran.、Distinct microbial communities among different tissues of citrus tree Citrus reticulata cv.

利用基于培养和非培养的方法对柑橘及其相关物种的根微生物群进行评估，结果显示，与根围土壤相比，根际中变形菌门和拟杆菌门细菌种类丰富，而与蓝藻门、厚壁菌门、酸杆菌门和放线菌门有关的细菌种类则减少(表1)。柑橘根际以真菌门子囊菌科、担子菌科和较小程度的小球菌科为主;然而，只观察到分布在子囊菌门的属在根际的选择性富集。在柑橘根际中发现了多个古菌门类，如Crenarchaeota、Euryarchaeota和Thaumarchaeota，尽管它们在根围土壤中的相对丰度高于根际。田间条件下柑橘微生物组的门水平分类与全球收集的样本相似，表明宿主通过选择特定性状驱动招募。在柑橘根际中富集的细菌和真菌门在其他植物根际中也占主导地位。这种定义的系统发育组织表明，与植物相关的微生物组并不代表随机组合，而是按照群落组装的一般规则构建的。

除了细菌、真菌和古菌外，与植物相关的微生物群落还包括其他微生物，如原生生物、线虫和病毒。虽然原生生物、线虫和病毒是植物相关微生物组的一致成员，但我们对它们的结构和对宿主性能的贡献的了解非常有限。最近的研究表明，原生生物可以通过捕食效应控制微生物组的多样性和结构，并有助于植物的生长和适应性提升。Xu等人(2018)报道了全球柑橘微生物组中来自原生动物和藻类的基因。全球柑橘微生物组中的一小部分(0.02%)属于病毒。形态学和显微研究已经报道了柑橘根际的几种线虫(Eisvand et al . 2019;Mankau and Gaspard 1986)。与柑橘根际相关的线虫主要为Agamermis属、Alaimus属、Aphelenchus属、Hemicriconemoides属、diphtherophhora属、Monoacrosporium属、Nanidorus属、Pratylenchus属、Tylenchorhynchus属和Tylenchulus属(表1)。然而，上述分类群对柑橘寄主的作用和后果尚不清楚。在未来，基于宏基因组的定向方法应该用于探索柑橘微生物组中除细菌和真菌以外的微生物。

根面微生物

根面(即根表面)(图1)是调节微生物进入根的关键通道. 因此，与根际相比，根面生态位受到宿主施加的选择压力要大得多。只有某些微生物成员从根际成功富集到根面，这可能反映了宿主对生态位分化微生物的偏好和适应策略。然而，与柑橘根际微生物组相比，柑橘根面微生物组在很大程度上仍未被探索，部分原因是根际样品收集程序的困难，其中需要超声或剧烈震动处理，并且可以收集的微生物细胞比根际样品收集程序少得多。最近，Zhang等(2017)调查了柑橘根面微生物组的组成，其中数百克柑橘根芯用于根面微生物细胞收集;他们进一步使用鸟枪宏基因组学方法比较了柑橘根际和根面微生物组的分类组成，并确定了与变形菌属(以慢根瘤菌和伯克霍尔德菌为两个最主要的属)相关的多个细菌属，这些细菌属表现出强烈的根际到根际富集模式(表1)。根际到根面的大多数减少分类群与放线菌属、酸杆菌属和古生菌属有关。Zhang等(2017)通过宏转录组学分析进一步揭示了这些根际-根面生态位分化微生物的适应机制，并发现微生物-植物和微生物-微生物相互作用中涉及的功能属性，如III型和VI型细菌分泌系统及其相关效应物、脂多糖、和趋化性是微生物在植物宿主免疫系统的监督下向根面生态位富集以享受易于使用的植物源碳源的关键，而根际到根面减少的微生物大多是自养的。值得注意的是，不同的微生物类群可能采用特定的策略来适应根面;例如，细胞运动相关的功能特性对伯克霍尔德氏菌很重要。而这些功能对慢生根瘤菌来说似乎并不重要。在根际到根面富集过程中。生物信息学的最新发展使基因组中心的宏组学（meta-omics）分析成为可能，并阐明了微生物在物种水平甚至菌株水平分辨率下的生态位适应机制，而无需培养。例如，Zhang等人(2020)恢复了一个近乎完整的细胞弧菌宏基因组组装基因组，其中包含多个编码植物细胞降解酶的基因，并使用整合的宏基因组学和宏转录组学方法分析了为什么细胞弧菌在根际富集。差异基因表达分析表明，与根际相比，细胞弧菌下调了植物细胞壁降解相关基因的表达，但上调了参与抑制植物免疫反应和拮抗根际其他微生物的基因。

大多数柑橘根际到根面的富集属经常被报道为植物有益菌，这表明为什么这些分类群被柑橘宿主偏爱，以及这些被选中的微生物如何促进植物健康和适应性(表1)。两株隶属于伯克霍氏菌(Burkholderia)的柑橘根源菌株，是柑橘根面微生物组中第二大优势属，具有很强的根际-根面富集模式，通过接种实验发现，它们在根面的适应率高于根际，这与基于宏基因组学的结果一致。体外和植物实验均表明，这两株伯克氏菌均能直接抑制多种柑橘病原菌的生长，如互交疫病菌、急性炭疽菌、柑橘Phyllosticta citricarpa、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、棕榈疫霉(Phytophthora)、棕榈疫霉(Phytophthora)、棕榈疫霉(Phytophthora)等，并通过诱导柑橘宿主的全身抗性来帮助柑橘宿主抵抗其他病原菌。对这两种菌株的基因组分析进一步确定了参与病原体拮抗活性以及其他有益性状(如磷酸盐溶解和植物激素产生)的基因簇。Cellvibrio是柑橘根际核心微生物组的一员，从根际进一步富集于柑橘根面;以基因组为中心的宏基因组学和宏转录组学分析表明，除生长素产生等其他有益机制外，Cellvibrio可能通过拮抗真菌病原体对柑橘宿主有益。

到目前为止，据我们所知，还没有基于培养的研究来调查柑橘根面微生物群的有益功能。有趣的是，Blacutt等人(2020)开发了一种高通量细菌和真菌培养和鉴定管道，以筛选潜在的有益微生物。然而，某些生长缓慢的微生物，如慢生根瘤菌，在本研究和先前的基于培养的研究中未被发现，证明了进一步改进基于培养的方法的必要性。然而，培养组学和生物信息学方法可能有助于我们理解这些来自根面植物偏好微生物是如何在根际中丰富的，从而促进柑橘的健康和适应性。

内生微生物

植物寄主对内生菌生态位施加的选择力(图1)比体外微生境(根际和根表)强得多，与根际微生物群相比，内生菌群中的微生物数量大约减少了五倍(Reinhold-Hurek等2015;Wang et al . 2020)。最近对柑橘内源性微生物组的研究主要通过16S核糖体DNA (rDNA)高变区测序或基于培养的方法进行，以表面消毒的根为工作材料。变形菌门、厚壁菌门、a和放线菌门是柑橘植物内菌群中最主要的门，根据培养和非培养研究显示，伯克霍氏菌、变异菌、芽孢杆菌、短芽孢杆菌、a和Paenibacillus等有益属经常被报道(表1)。据报道，大部分分离的柑橘内啡肽细菌具有有益的性状，如磷增溶、吲哚- 3-乙酸生产、固氮、1-氨基环丙烯-1羧酸脱氨酶生产、水杨酸生产、铁载体生产和几丁质酶生产，这表明宿主招募的内啡肽微生物如何促进柑橘的适应性。健康柑橘树的内源性微生物组组成相对稳定，但植物病害对微生物组组成有深远影响(表1)。在患病树木中，微生物组中假定有益细菌的相对丰度也有所下降，这表明病原体对微生物组的潜在影响通常被不应有地忽视。然而，内啡肽中微生物对植物健康的定量贡献仍有待确定。重要的是，之前的大多数研究在样品收集过程中没有区分柑橘根际和内根成分，其中分析的微生物组被共同定义为根微生物组。

到目前为止，还没有对柑橘内生菌或所谓的根微生物组进行宏基因组学或宏转录组学研究，可能是因为很难从微生物组中去除宿主DNA和RNA，这阻碍了我们对内生菌微生物组的理解。在这种情况下，对根适应微生物与其非植物相关的近亲进行比较基因组分析是一种很有希望的方法，可以揭示微生物在根内胚层内适应的关键功能属性;此外，高通量基因突变和随机条形码转座子测序等筛选方法可以进一步识别特定微生物根生态位适应的个体基因和途径。此外，在微生物DNA纯化之前，通过裂解宿主细胞和降解宿主DNA来去除宿主DNA(例如HostZERO微生物DNA试剂盒)或通过宿主和微生物之间的DNA甲基化差异来消耗宿主DNA(例如NEBNext微生物组DNA富集试剂盒)的快速发展的方法有望有效提高微生物DNA在总DNA中的百分比，从而推进宿主相关微生物组的宏基因组分析。值得注意的是，Song和Xie(2020)开发了一种CRISPR-Cas系统，该系统可以特异性识别和降解来自线粒体和质体的植物源16S rDNA序列，从而以更低的成本实现更深入的基于16S rDNA的细菌群落分析。

叶际微生物

叶际生态位被定义为微生物定植的植物地上部分(Liu et al . 2020)(图1)。在叶际定植的微生物除了暴露于植物寄主的免疫反应之外，还暴露于各种非生物(例如，降雨、热量和紫外线辐射)和生物(例如，昆虫来访以及风或其他载体引入的微生物)胁迫和农业实践中。柑橘叶际细菌群落以变形菌门、厚壁菌门和放线菌门为主，与柑橘根相关菌群相似;然而，这些门之间的比例在不同地理位置、柑橘品种和健康状况的树木之间存在显著差异(表1)。此外，拟杆菌门类群在柑橘叶片微生物组中的含量要高于柑橘根相关微生物组。由于大规模的宏基因组学或宏转录组学尚未对柑橘层状圈群落进行过研究，因此健康层状圈微生物组的关键功能属性在很大程度上仍然未知。结合功能微生物组的研究对于了解叶表面和叶内微生物组的功能，以及如何利用叶际微生物促进植物的健康和适应具有重要意义。

柑桔核心微生物组的分类和功能组成

以关联的持久性为标准(例如，在超过75%的测试个体中检测到的分类群)，“核心微生物组”被定义为宿主微生物组中常见的微生物组。柑橘根际、根、茎和叶室的核心微生物群已经被阐明(图2)。这些核心微生物组成员被认为在组织植物相关微生物组的组装中发挥关键作用，而不仅仅是促进寄主植物的生长。柑橘微生物组的核心成员在不同的隔间中是不同的;具体来说，柑橘各个部分的核心细菌群落由Sphingobium属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Chitinophaga属、Mesorhizobium属、Steroidobacter属、Cupriavidus属、Dokdonella属、Novosphingobium属、Hylemonella属、Rhizobium属、Roseateles属、Phenylobacterium属、Devosia属、Niastella属、Rhodoplanes属、Halomonas属、Bacillus属、Sphingomonas属和Streptomyces属组成(图2)。核心真菌根际微生物组的多样性明显低于细菌，包括7个真菌属，隶属于子囊菌科、担子菌科和肾小球菌科(图2)。在其他系统中，隶属于这些核心属的多个成员被称为植物有益微生物，可能有助于维持植物激素平衡，控制根系发育，促进营养获取和预防植物宿主的疾病表现。有趣的是，柑橘核心微生物群中丰富的细菌类群也被发现是其他植物物种根际的优势成员，表明存在一个通用的核心植物微生物组。

图2 核心柑橘菌群。该图由Blaustein等人(2017)、Xu等人(2018)和Ginnan等人(2020)的数据生成。核心微生物组细菌仅在不同部位间呈现重叠属。

到目前为止，核心微生物群是基于分类和驱动植物与微生物相互作用的功能方面来定义的，包括定植、竞争和信号传导。由于植物相关微生物组功能性状的重要性，在全球范围内确定植物物种的“核心功能微生物组”已成为重点。由于宿主DNA和RNA难以从微生物组中去除，以往的研究报道了柑橘根际微生物组的核心功能性状，但没有报道根和叶微生物组的核心功能性状。柑橘根际微生物组的核心功能性状富含介导植物-微生物和微生物-微生物相互作用、养分获取和植物生长促进的微生物性状(图3)。柑橘根际微生物群中存在大量转运体，包括atp结合盒体、磷酸转移酶系统和药物或代谢物转运体，它们可以进口各种植物来源的营养物质(图3)，这可能允许根分泌物和微生物生长之间的微调，从而能够从块状土壤中选择性地招募根际微生物群。在已知与植物宿主直接相互作用的性状中，如细菌分泌系统和其他外表面蛋白，存在强烈的正向选择，这表明植物免疫反应在塑造柑橘根际微生物群方面做出了贡献。与根围土壤相比，根际中参与碳固定和氨基酸生物合成途径的基因的枯竭表明植物源性养分的有效利用，进一步提供了在营养丰富的植物环境中定殖的选择优势。柑橘根际中转录因子的富集表明基因功能的紧密协调涉及代谢、群体感应、运动、应激反应和宿主-微生物相互作用。柑橘根际中富含促进植物生长的基因，如养分动员(如磷、氮和铁的运输和利用)，诱导植物防御反应(如水杨酸合成)，以及直接对抗病原体(如毒素和抗菌化合物的产生)(图3)。这些观察结果表明微生物组介导的功能在促进植物健康和性能方面的重要性。

图3 柑橘微生物组核心功能性状研究。该图由Xu et al(2018)的数据生成。左侧为减少功能性状，右侧为核心根际功能性状。T6SS = 6型分泌系统，T5SS = 5型分泌系统，以此类推。

柑橘根相关微生物组与其他植物根相关微生物组的比较

我们比较了柑橘和其他14种植物的微生物组组成，基于16S rDNA测序数据。我们发现，在柑橘根部相关的微生物组中，丰富的门，包括变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、双胞菌门、plantomycetes、Nitrospirae、Verrucomicrobia和Spirochaetes，在其他14个植物物种中也占主导地位(图4)。在更高的分辨率下，我们鉴定出了20个属，包括Pseudomonas、Flavobacterium、Steroidobacter、Nitrospira、Bacillus、Bradyrhizobium、Burkholderia、Rhizobium、Mesorhizobium、Devosia、Sphingomonas, Flavisolibacter, Paenibacillus, Geobacter, Hyphomicrobium, Cellvibrio, Novosphingobium, Pedomicrobium, Phenylobacterium, a和Bdellovibrio在所有植物物种中占主导地位(图5)。共同丰富的植物根相关分类群的含义仍有待探索。

图4 利用16S数据鉴定的15种植物根相关微生物群在门水平上的分类分布。数据来源于公共数据集。

图5 利用16S数据对15种植物根相关微生物群进行属级鉴定。数据来源于公共数据集。

病害对柑橘菌群的影响

植物与微生物的相互作用是植物性能和生态的关键驱动因素。由于其巨大的经济意义，植物-病原体相互作用是植物-微生物相互作用的一个特别关注的方面，并得到了广泛的研究。该领域的大多数研究都采用“单一物种和单一栽培”的思维方式，旨在更好地理解植物病原体和植物免疫反应的分子机制，并对寄生或有益微生物如何与其植物宿主相互作用提供了有价值的见解。然而，在自然界中，微生物与其他微生物物种经常生活在一起，直接或间接地相互作用，并形成多物种群落。病原体的引入有可能扰乱植物与其相关微生物群之间的精细相互作用。群落结构的变化以及本地微生物群与病原体自身毒力因子产生的相互作用可导致宿主健康和生产力的迅速下降。阐明传入病原体与微生物组中本地居民之间可能的相互作用及其结果对植物适应性促进具有很大的希望，并获得越来越多的兴趣。

先前的研究已经检查了入侵病原体如“中国亚洲韧皮杆菌”对柑橘相关微生物组的研究(表2)。这些报告证明了叶片中整体群落组成的重组，茎，根、根面和根际。总的来说，α多样性的减少是由于“中国亚洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter asiaticus”的定殖和黄龙病(HLB)的发展。Araujo等人(2002)报道了内生微生物群落对由木杆菌引起的柑橘斑绿病(CVC)的显著变化。柑橘根部被取食纤维根的半透线虫(Tylenchulus semipenetrans)感染，会引起根际微生物群的变化，导致巨型芽孢杆菌和洋葱伯克氏菌的丰度增加。这些细菌种类的富集对根腐病菌疫霉(Phytophthora nicotianae)的生长有负面影响。HLB将根际微生物群落从主要的“共养”(快速生长，利用不稳定的C源，在根际占主导地位)转变为“寡养”(缓慢生长，利用顽固性的C源，在块状土壤中占主导地位)。根际微生物群落的变化以及根际到根面对HLB的进一步富集行为表明，负责从根围土壤中选择性招募微生物的“根际效应”受到HLB疾病的负面影响。这些观察结果表明，病原体暴露(中国亚洲韧皮杆菌)作为专性内生细菌，即使在缺乏直接竞争效应的情况下，也能重构本地微生物群落。在这种情况下，微生物群落的重组被认为是由植物生理学的变化所驱动的，这些变化导致根际光同化物质分配的定量和定性变化。

已经提出了一种疾病生态学模型，该模型说明了病原体、微生物组内微生物种群的富集或消耗与寄主植物之间的关系(表2)。该模型预测了原生柑橘微生物群落成员作为疾病促进者或抑制者的作用，并且在研究柑橘微生物组时产生了许多基于dna的方法的可测试假设。此外，通过对感染hlb的叶片样本的网络分析确定的共发生模式表明，中国亚洲韧皮杆菌和一些属于柑橘核心微生物群的原生细菌。很少有研究表明中国亚洲韧皮杆菌的丰度与在根和叶中的几种细菌种类之间有正相关关系。Fujiwara等人(2018)证明了中国亚洲韧皮杆菌依赖于与柑橘相关微生物群的特定亚群的相互作用，这些微生物群主要由Comamonadaceae, Flavobacterium, microbacteraceae和Pseudomonadaceae家族成员组成。消除特定亚群的抗生素应用显著降低了中国亚洲韧皮杆菌。在CVC的病理系统中，CVC的症状与甲基杆菌的分离频率有关。体外相互作用实验表明，内生菌Methylobacterium extorquens 可以刺激苛养X.的生长。这些数据表明，传入的病原体与本地微生物群落相互作用，定植和构建病原体相关群落，从而刺激疾病的发展。虽然尚不完全清楚，但常驻微生物与病原体相互作用的可能机制可能涉及微生物间的相互作用、对植物宿主的影响、对养分和空间的竞争、代谢物的产生、生态位环境的变化，或与选定的本地微生物共同作用，形成稳定的联盟，从而使群落成员互惠互利。

与HLB疾病相关的树木衰退被认为不仅仅是由于中国亚洲韧皮杆菌丰度的增加。同时也是本地微生物群落从共生或共生微生物向致病或腐生微生物的富集转变的结果，特别是在根部位(表2)。随着疾病严重程度的增加，受hlb影响的根样品中真菌门Glomeromycota的相对丰度显著降低。其中含有多种共生菌根真菌，为植物提供重要益处，包括营养吸收和耐受性。在hlb病柑橘根系中有益种肾小球菌的相对丰度下降的同时，真菌属镰刀菌和赤霉素的数量显著增加。已知镰刀菌和赤霉素的成员都能引起植物疾病，包括由尖孢镰刀菌引起的柑橘干根腐病。此外，当树木感染HLB时，疫霉菌发病率增加。Graham等人(2013)报道了HLB和疫霉菌(Phytophthora spp.)在引起柑橘症状前纤维根衰退中的潜在相互作用。抑制外来病原体对植物的防御反应，为本地腐生植物或病原体在不同的植物生态位上定植提供了机会。Li et al .(2017)研究表明，中国亚洲韧皮杆菌通过降解水杨酸，增强了柑橘植物对柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)非致病性和致病性菌株的敏感性。疾病进展可能会对稳定微生物群落的关键物种的相对丰度产生负面影响，从而导致植物相关微生物群的生态失调(Agler et al . 2016)。据报道，由于中国亚洲韧皮杆菌感染导致的关键物种的丧失会触发级联过程，从而破坏柑橘相关微生物群的结构。

表2 病害对柑橘菌群的影响综述
疾病或病原体	主要发现	参考文献
黄龙病（HLB）	α多样性的减少	Defining the core citrus leaf- and root-associated microbiota: Factors associated with community structure and implications for managing huanglongbing (citrus greening) disease、Huanglongbing alters the structure and functional diversity of microbial communities associated with citrus rhizosphere.
	HLB改变了根际微生物群落从主要的富营养化到贫营养化	Huanglongbing alters the structure and functional diversity of microbial communities associated with citrus rhizosphere.、Tale of the huanglongbing disease pyramid in the context of the citrus microbiome
	说明病原、微生物组内微生物种群的富集或消耗与寄主植物之间的关系;微生物群落从共生或共生的富集转向致病或腐生微生物	The Candidatus Liberibacter–host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.、Huanglongbing impairs the rhizosphere-to-rhizoplane enrichment process of the citrus root-associated microbiome
	中国亚洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)的丰度与几种细菌种型呈正相关	Defining the core citrus leaf- and root-associated microbiota: Factors associated with community structure and implications for managing huanglongbing (citrus greening) disease、Alterations of Candidatus Liberibacter asiaticus-associated microbiota decrease survival of Ca. L .asiaticus in in vitro assays、Disease-induced microbial shifts in citrus indicate microbiome-derived responses to huanglongbing across the disease severity spectrum.、Bacterial diversity analysis of huanglongbing pathogen-infected citrus, using phyloChip arrays and 16S rRNA gene clone library sequencing、Huanglongbing, a systemic disease, restructures the bacterial community associated with citrus roots.
	HLB对柑橘菌群的影响受多种因素的影响	Defining the core citrus leaf- and root-associated microbiota: Factors associated with community structure and implications for managing huanglongbing (citrus greening) disease、Disease-induced microbial shifts in citrus indicate microbiome-derived responses to huanglongbing across the disease severity spectrum.
	通过各种降低疾病严重程度的策略，破译了hlb病柑橘微生物组的变化	Penicillin trunk injection affects bacterial community structure in citrus trees.、Deciphering bacterial community variation during soil and leaf treatments with biologicals and biofertilizers to control huanglongbing in citrus trees、Deciphering the bacterial microbiome in huanglongbingaffected citrus treated with thermotherapy and sulfonamide antibiotics.、Deciphering the bacterial microbiome of citrus plants in response to ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’-infection and antibiotic treatments.
柑橘斑绿病(CVC)	内生甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)刺激了植物内生微生物群落对CVC和CVC的响应	Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants.、Interaction between endophytic bacteria from citrus plants and the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa, causal agent of citrusvariegated chlorosis
纤维根线虫	诱导根际微生物组的变化导致巨芽孢杆菌和洋葱伯克氏菌的丰度增加	Tylenchulus semipenetrans alters the microbial community in the citrus rhizosphere
疫霉病Phytophthora nicotianae	巨芽孢杆菌和洋葱伯克氏菌的富集对根腐病菌的生长有不利影响	Tylenchulus semipenetrans alters the microbial community in the citrus rhizosphere

病害对柑橘微生物组的影响受多种因素影响，包括地点、砧木、接穗、树龄、取样时间、症状和病害耐受性(表2)。由于HLB发展产生柑橘相关微生物组的变化导致了与疾病早期和晚期相关的微生物特征的鉴定。例如，在HLB进展的早期至中期，根中的Exophiala sp.和Lactobacillus sp.以及叶片中的Aureobasidium sp.和Methylobacterium sp.的种群显著增加，而在高症状树中显著减少。另一方面，在严重病树的叶片中发现的喜树属(Camptophora sp.)和Acrodontium sp.的种群数量显著高于中度病树。一些研究还揭示了在采取各种降低疾病严重程度的策略后，黄龙病柑橘微生物组的变化。尽管微生物群落组成的变化因施用生物肥料而波动，但抗生素的施用和热疗，很难推断群落是回到了原来的组成还是进一步转向了另一种组成。

一些研究已经检查了植物病原体对植物相关细菌群落结构的影响(上文讨论);然而，我们对植物相关微生物组在响应疾病进展时的功能特征了解有限。我们对这些变化对生态系统水平功能和植物-微生物组相互作用的影响也知之甚少。Zhang等人(2017)利用鸟枪宏基因组学和宏转录组学方法证明，HLB损害了柑橘根际到根面微生物组的富集过程。两种最占优势的根际富集属，慢生根瘤菌和伯克霍尔德菌，在hlb感染的根际中显著减少。在选择性压力下，许多与功能性状相关的基因(包括与移动性、趋化性、分泌系统和群体感应相关的基因)因HLB而显著减少。Trivedi et al(2012)利用GeoChip分析表明，与健康柑橘树相比，HLB柑橘树根际微生物群中参与N和P循环的各种基因显著减少。由于与植物相关的微生物群落的多样性和稳定性严重影响土壤质量、植物生产和生态系统过程，因此微生物群落结构和功能的波动可能对生态系统的可持续性产生严重影响。

操作或工程柑橘微生物组的潜力和应用

新兴的“呼救”假说认为，植物会招募特定的微生物，这些微生物能够在特定情况下减轻植物的压力。。也有证据表明，植物招募特定的有益微生物来促进植物免疫。利用植物相关微生物群的大部分未开发的功能潜力具有巨大的潜力，通过改善营养吸收，增强对环境胁迫的耐受性，并提供对病虫害的保护，来扩大其宿主的基因组能力。在这种背景下，微生物组工程最近成为促进植物与微生物组积极相互作用以提高植物适应性的替代方法。与上述抗生素治疗相比，微生物组工程方法在环境安全和甚至公共卫生(例如，避免抗生素污染和ARG传播)方面提供了一种更安全的替代方法。

在柑橘中发现了“求救”假说的一些迹象，其中疾病发展的早期阶段导致某些微生物群的丰度增加，据报道这些微生物群具有植物生长促进特性。对疾病逃逸树(即高发病率的柑橘林中看起来健康的树木)的系统调查已经导致具有促进植物生长和生物防治潜力的微生物的鉴定、分离和表征。这些“逃脱”的柑橘树与有症状的树具有相同的基因型，并且在相似的环境条件下生长。因此，有人提出，由于其相关的微生物群落组成，逃脱树的耐受性不同。与有症状树相比，逃逸植物的微生物群落富含具有多种有益性状(即固氮、溶磷、产生植物激素和缓解应激酶)的微生物。其他研究也分离和鉴定了柑橘相关微生物的有益特性，包括对柑橘病原体的拮抗活性，其广泛目标主要是通过应用由单一或有益菌株组合组成的生物接种剂来操纵微生物组。最近，Blacutt等人(2020)开发了一种高通量培养和分类鉴定管道，以建立一个存在于HLB疾病环境中的柑橘相关微生物库。进一步筛选库中潜在的抗中国亚洲韧皮杆菌的生物接种剂。已经对一些菌株进行了测序，以更好地了解有益性状和植物定植能力的基因组特征。

利用温室试验进行的植物试验揭示了接种有益菌株对柑橘生长和性能的积极影响。根施三种根菌菌株可减轻柠檬X.酸杆菌引起的溃疡病症状。通过诱导葡萄柚的全身免疫反应。在长春花中接种flacfaccurtobacterium可以降低木杆菌的种群水平，从而减少CVC症状。Giassi等人(2016)表明，一些分离株能够促进柑橘砧木的生长;然而，这种反应依赖于基因型和微生物分离物。柑橘砧木接种菌根真菌提高抗旱性证明了常见的菌根网络可以将受感染的水杨酸信号传递给邻近的健康幼苗，从而激活邻近植物的防御反应。尽管在温室试验中显示出显著的促进植物生长的效果，但微生物接种在田间的成功仍然是不可预测和不可靠的。这可能是由于微生物生物接种剂无法有效地与本地微生物群竞争，无法在与植物相关的环境中定植，以显示其有益的特性。此外，重要的是要考虑微生物组的动态特性和病原体的特性，以便将有益微生物应用于特定的位置和时间，以最大限度地发挥有益效果。例如，用有益菌处理更容易受到柑橘黄单胞菌感染的未成熟叶片，对柑橘溃疡病显示出良好的效果，可能是通过占据气孔下的空间及其抗菌活性或诱导植物防御。

近年来，在低估植物相关微生物组的组成和功能潜力方面取得了重大进展。由于微生物组工程已被确定为提高植物对生物或非生物胁迫的抗性的主要途径，开发微生物接种剂以增强这些功能的兴趣和投资最近激增。有效利用微生物群需要新的方法，认识到生活在自然和管理系统中的微生物通常是作为群落而不是作为单独运作的单一生物群体。支撑复杂微生物群落的基本生态和设计原则尚处于起步阶段，但对农业系统中微生物群落的合理设计和操纵至关重要。建模和数据可视化技术的进步使我们能够识别协调微生物组结构和功能变化的关键微生物。新的高通量培养方法可用于选择性地分离驱动与植物性能相关的关键微生物相互作用的关键微生物。例如，使用网络分析，Blaustein等人(2017)确定了几个与中国亚洲韧皮杆菌呈负相关的微生物群。这些原生微生物可能是开发微生物接种剂来控制HLB的主要目标。值得注意的是，从观察到应用并不是一个简单直接的过程，需要从这些候选微生物群中确定适用的接种剂，因为微生物组中属于同一分类单元的个体在病原体拮抗和植物定植方面表现出不同的能力，因此，应该分离和评估相对较大的目标微生物种群，以获得适合现场应用的分离物。

我们设想，对植物-微生物组相互作用的详细了解将使我们能够合理地设计具有广泛，持久和灵活的自然环境中植物生长促进活动的微生物群落。提高微生物接种剂存活率和活性的新策略，包括使用选定的本地微生物和优化微生物递送方法，以及现代基因编辑工具(RNAi、CRISPR/Cas9等)来设计微生物接种剂，将为原位微生物组工程提供一条前进的道路。鉴定和应用能够特异性靶向病原体但不杀死微生物组中有益微生物的抗菌化合物是控制疾病的另一种潜在有效手段。在田间条件下验证微生物产品的功效将进一步指导大规模采用创新的微生物组技术，以在一系列环境背景下对抗植物疾病和抗逆性。除了开发优化的微生物接种剂外，我们还设想使用表达参与信号交换的微生物电路的设计植物直接操纵微生物组，从而操纵微生物组以获得所需的利益。例如，已经开发出合成生物学方法来设计植物中的跨界信号传导，以控制根际细菌中的基因表达。此外，据报道，陆生植物通过遗传网络控制内生层层微生物群的水平和多样性，以防止生态失调。因此，随着CRISPR技术的快速发展及其在柑橘上的应用，通过对宿主进行基因组编辑来操纵微生物组成为可能。这些进展将开辟新的途径，重新连接植物与微生物群的相互作用，以激活微生物群的特定成员来固定N2，产生抗生素或激素，螯合铁或溶解土壤养分。这些即将到来的工具和技术，使我们能够设计植物相关的微生物组，迫切需要从HLB危机中拯救柑橘。

图6 柑橘微生物组研究的方法与问题。红色强调了目前对柑橘微生物组的了解进展

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