高效提取分离细菌内膜和外膜蛋白

本文来自学习一篇科研论文：Systematic Localization of Escherichia coli Membrane Proteins

目前研究细菌内外膜蛋白大多是采用预测的方式，经常出现不准确的结果。蔗糖密度梯度离心是分离内膜蛋白和外膜蛋白非常有效的方法，其中外膜蛋白通常由两亲性的beta-绳索结构进而形成beta筒状结构，通过N端脂质化的半胱氨酸残基绑定到细胞外膜上。

 

细菌外膜蛋白提取步骤：

1、培养2L 细胞至OD600=0.8-1.0，7000rpm，离心10min收集细胞，用20ml 冰冷的 20% 蔗糖溶液（10mM pH 8.0的Tris溶液，添加 50ug/ml 的DNase I）重悬细胞，室温下孵育15 min。

注意：细胞在20%蔗糖溶液中会冻住来增强裂解，而且20%蔗糖溶液促进细胞质壁分离，更有利于分开细胞的内膜和外膜。

2、法国压力细胞压壶用15000psi压碎细胞两次，like将压碎的细胞转移到冰上抑制蛋白酶的活性。

3、3000rpm，4℃，10 min 离心去除细胞碎片

4、（一步蔗糖梯度提取法）。

5、对于外膜和内膜的粗分离，采用两步梯度法：

SW41 转子                                                      SW27/8转子                             

4 ml 70% 蔗糖                                                 14 ml 70%蔗糖

4 ml 60%蔗糖                                                  14 ml