深度突变扫描的步骤：可用于文库构建、功能筛选和高通量测序

随着高通量测序技术的发展和各种酶的发现和应用，深度突变扫描成为筛选突变体、蛋白定向进化等相关研究的高效手段：

所需试剂：构建基因随机点突变的试剂盒，用于筛选的宿主菌株，连接转化所需试剂，质粒提取操作等相关生化试剂。

仪器：Qubit定量设备、高通量测序平台（Illumina、Miseq、Hiseq）、凝胶电泳系统、PCR和qPCR仪器

主要步骤：

1、选择候选蛋白的有效功能域，根据相对应DNA序列选择合适的突变位点；

注：当选择突变位点的序列大小时，主要考虑高通量测序平台能够测得的序列长度，比如Illumina MiSeq平台最大测序长度为500bp，因为Illumina 测序技术出错的概率大概在1%，可以考虑通过双端测序将出错率降低到~0.01%。所有这些限制导致reads的读长在250bp或83个氨基酸。

2、订购合成构建突变体文库的引物，根据易错PCR的出错频率计算错误插入出现的概率。

3、通过酶切连接或者Gibson同源重组等策略将变异基因文库克隆进入低拷贝表达质粒。

注：克隆进入尽可能多的变异（10^5~10^6）是有帮助的，使用低拷贝质粒保证每个细胞都有一到两个基因拷贝，并且拷贝之间没有太大的变化。而且在蛋白表达时可以避免高拷贝质粒带给菌株的压力。

4、将混合质粒文库转化进入高效的感受态细胞.

注：尽可能增加文库的多样性，提高高通量测序的效率，提高不同实验批次之间的重复性。例如：如果需要获得一千万条reads，则至少应该获得1x10^5个转化子，允许每个变异测100条reads。如果产生了太多的转化子，后续可以采用总转化的一个子集。

5、用合适的