纳米抗体固相筛选相关问题

固相筛选法就是将纯化或充足的抗原包被在固相介质上（如酶标板、亲和层析柱和免疫试管），然后再加入带筛选的噬菌体抗体库孵育，经过多次“吸附-洗涤-解离-扩增”的过程，洗去非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体，回收结合上的噬菌体抗体。下面是一些固相筛选实验过程：

一．抗原、抗体结合时间的选择

在包被抗原的ELISA板孔中，分别加入抗原噬菌体抗体以及非特异性的噬菌体抗体，结合时间可以设置1、10、20、30、45min及1、1.5、2h。用PBST洗涤5次后，加入1:5000 HRP-羊抗M13抗体，再加入PBST洗涤5次，加HRP底物显色液并终止后，测定A值。

二．洗涤条件的选择

在包被抗原的ELISA孔板中，分别加入上述类型的噬菌体抗体，反应2h后，采用不同的洗涤条件进行洗涤，以PBST洗5次，以PBS和PBST各洗5次，以PBS洗5次后再以PBST洗10次，以PBS和PBST各洗10次，之后同上进行噬菌体的ELISA检测。

三．缓冲液pH的选择

在包被抗原的ELISA板孔中，分别加入上述类型的噬菌体抗体，于37℃温育2h。分别采用pH3、4、5、6的醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤10min后，同上进行噬菌体抗体的ELISA检测。

四．抗原包被浓度对筛选结果的影响

用浓度分别为1、2、4、6及8mg/L的抗原包板，加入100µL混合的噬菌体抗体，于37℃温育2h。然后以PBST和PBS各洗板20次，加入100µL E coli TG1，于37℃温育1h。然后稀释105后涂板，置30℃培养过夜。从不同筛选条件所得的平板上各挑96个单菌落，进行噬菌体抗体的竞争ELISA检测。

五．噬菌体抗体的竞争ELISA法检测

噬菌体抗体上清与等体积MPBS（含40 mLL牛奶的PBS）混合，室温静置30 min。同样，将样品与等体积含抗原的MPBS混合，室温静置30min。各取100μL加入到包被抗原的板中反应1 h，以PBST洗涤5次。加入1:5 000 HRP-羊抗M13抗体，于37℃孵育1h；同上洗涤后，加HRP底物显色液显色15 min，以2 mol/L H2SO4终止反应后，于波长450/620nm测定A值。抗原竞争达到50%以上的克隆视为阳性，即有抗原竞争的A值为无抗原竞争的A值50%以下的克隆即为阳性。

六．洗涤过程产生的影响

严谨度过高，可使一些表达较低的克隆被筛掉,而这些克隆中可能含有亲和性极高的目的噬菌体；严谨度过低，又可导致噬菌体的富集过程太慢，筛选轮数增加。考虑降低洗涤强度（PBS洗涤液中不加土温）以及减少洗涤次数。

七．抗原浓度的确定

现在普遍认为：低浓度的抗原应优先用于筛选高亲和力的抗体，而高浓度的抗原则有利于低亲和力抗体的筛选。需要注意的是，筛选用的抗原存在一个有效的浓度，不是所有用于包被的抗原都能有效的用于筛选，抗原的有效浓度必须要达到一定的值。但有效抗原浓度又不能高于10-6mol/L，此时反而会使特异性抗体的富集效果下降。