动物细胞无血清培养基的发展和应用

商 瑜，张启明，李 悦，王莹冰 （北京师范大学 生命科学学院，北京 １００８７５）

摘 要：

随着生物医药产业和生命科学基础研究对动物细胞培养规模、效率和安全性能要求的不断 扩大和提高，无血清培养基的研制和开发已经成为细胞工程领域的重要课题。无血清培养基的发 展历经了无血清来源、无动物源、无蛋白和化学成分限定培养基等四个阶段，逐步使得无血清培养 基的成分更为明确和简单，进一步提升了无血清培养基在细胞培养中可避免外源物污染等的优势， 使其在生物制品和生命科学领域获得了广泛的应用和发展。本文主要系统总结了无血清培养基的 发展历程、组分构成和优化方法，尤其对无血清培养基近年来在生物制品、干细胞培养及肿瘤研究 等方面的最新开发应用进行了扼要分析述论，以期对无血清培养基在生物学前沿领域的应用和优 化提供可借鉴的方向，尤其在肿瘤干细胞的方面可以进行更深入的探索。

关键词：无血清培养基；生物制品；细胞培养 中图分类号：Ｑ８１ 文献标志码：Ａ

　动物细胞培养技术近年来发展迅速，已经成为 生物工程领域中的前沿研究课题之一。其在生物制 品的生产、肿瘤细胞的体外建模、病毒的分离鉴定和 机体发育功能研究等方面均有重要应用。通常，为 了提供细胞生长所需的激素、生长因子等物质，动物 细胞是在含血清的培养基中进行培养的。但血清成 分复杂且不完全明确，批次间容易产生较大差异，培 养中易发生外源物污染，并且血清本身价格也比较昂贵等；这些均使得血清在生产和研究中的应用存 在诸多不利。目前，已有大量实验数据证实无血清 培养基不仅能避免或改善含血清培养基所带来的上 述缺陷，也能获得良好的培养效果并维持原有生物 学功能［１］。欧洲替代方法研究中心科学咨询委员会 （Ｔｈｅ ＥＣＶＡＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ， ＥＳＡＣ）和欧 洲 体 外 毒 理 学 会（ＥｕｒｏｐｅａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆ ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＩｎｖｉｔｒｏ，ＥＳＴＦＶ）等多个机构组织均发 表声明，强烈建议减少细胞体外培养过程中血清等 动物源性物质的添加，尽可能在现有细胞培养领域 使用无血清培养基［２］。由此可见，无血清细 胞 培 养 技术的研究日益受到人们的关注，并逐渐成为当今 动物细胞体外培养领域的主流与趋势。

无血清培养基的发展历程 无血清培养基是在合成培养基的基础上发展起 来的，与传统的培养基相比，既能满足细胞在体外长 时间培养的要求，又能避免动物血清所带来的不利 因素。无血清培养基的发展历程一般分为无血清培 养基、无动物源培养其、无蛋白培养基及化学成分限 定培养基等四类［３］。

１．１ 无血清培养基（Ｓｅｒｕｍ－ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ，ＳＦＭ）

无血清培养基，即为不添加动物血清。但 是 为 了满足细胞的生长，会添加替代血清功能的生物材 料，如转铁蛋白、胰岛素和动植物的提取物等。这使 得此类培养基中含大量动植物来源蛋白，添加物质 的化学成分也不够明确［４］。因此，会对后续 处 理 应 用造成部分不利影响（如目标蛋白的分离纯化），同 时成本也较高。由于人们可以就实际需求对其进行 相对简单的成分改进，使得其应用仍较为广泛。

１．２ 无动物源培养基（ＡｎｉｍａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔＦｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＡＣＦＭ） 此类培养基采用蛋白水解物、重组蛋白或其他 化学物质来取代动物源蛋白。它既可以满足细胞生 长及增殖的需要，还能够降低培养基的生产成本，提 高重组蛋白类药物安全性［５］。目前主要应用于生物 药品的研发和生产中。

１．３ 无蛋白培养基（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ，ＰＦＭ） 该 类 培 养 基 完 全 不 含 有 血 清 和 动 物 来 源 的 蛋 白，但仍包含来源于植物蛋白的水解物或合成多肽 片段等其他衍生物。由于所含蛋白极低，并且蛋白 成分明确，有 利 于 重 组 蛋 白 的 下 游 生 产、分 离 和 纯 化，总体成本也会大幅 下 降［６－７］。但 其 通 用 性 较 差， 需要针对目标细胞株进行特异性的优化［８］。目前主 要应 用 于 生 命 科 学 研 究 和 基 因 工 程 药 物 开 发 等 领域。

１．４ 化学成分限定培养基（ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＤｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ，ＣＤＭ） 此类培养 基 完 全 无 血 清、无 蛋 白，成 分 完 全 明 确，可以保证培养基批次间的一致性。它既有利于 跟踪细胞培养的代谢情况，在后续的分离纯化中也 非常方便，是目前最为安全和理想的培养基。可是 并非所有的细胞都能在化学限定培养基中达到较高 的表达水平，需要不断改进设计方案和配方［９］。 ２ 无血清培养基的组分构成和 设计优化

２．１ 无血清培养基的组分构成 无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的 补充因子两部分组成。基础培养基通常是按一定比 例的葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等组合而成的 合成培养基，它是维持组织或细胞生长代谢必不可 少的物质。而补充因子，替代了传统培养基中的血 清，既能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足动 物细胞培养的要求。补充因子根据需求的必要性一 般分为必需补充因子和特殊补充因子。必需补充因 子是所有细胞株在无血清培养基中生长时都需要 的，包括胰岛素和转铁蛋白等。特殊补充因子一般 含有激素、生长因子微量元素、贴壁和铺展因子、维 生素和酶抑制剂等。

２．２ 无血清培养基的设计优化 在无血清培养基的具体应用中，可以通过选择 或优化适当的基础培养基和补充因子的种类及用 量，使其更符合培养要求。例如，细胞工程的常用细 胞 ＣＨＯ 往 往 是 利 用 ＤＭＥＭ ∶Ｆ１２∶ＲＰＭＩ１６４０ （２∶１∶１）［１０］或者 ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３０２［１１］作为基础培 养 基，而 Ｖｅｒｏ 的 常 用 基 础 培 养 基 则 为 Ｍ１９９、 ＤＭＥＭ 或Ｆ１２等。对于补充因子，更是不断尝试优 化开发新的替代品。如必需补充因子中的胰岛素， 因其费用昂贵，目前有研究报道可利用金精三羧酸 （ＡｕｒｉｎＴｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ，ＡＴＡ）作为胰岛素替代 物培养 ＣＨＯ 细胞，细胞的生长正常，并极大降低了 成本［１１］。转铁蛋白是细胞无血清培养最重要的补 充因子之一，它的缺失会抑制细胞的生长，同时它也 是一些有害微量 元 素 的 螯 合 剂。Ｒｏｕｒｏｕ等 在 研 究 Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基时认为，维生素 Ｃ和柠檬酸 铁混合使用可以替代转铁蛋白，这为寻求转铁蛋白 替代品提供了参考［１２］。

通常，为了更好地达到无血清培养基组分优化 开发，研究人员可采用培养过程分析法、分子生物技 术法和统计学设计法等方法进行系统分析，进而获 得满足目标细胞生长要求的无血清培养基［１３］。

２．２．１ 培养过程分析法 培养过程分析法是以动 态的细胞代谢为基础，通过对细胞培养过程中各培 养基的组分进行实时监测，了解细胞的生理状态变 化，根据需求调整培养基组分及补料策略的设计方 法。在细胞培养过程中，各培养组分必须维持在一 定水平。因此可以通过消耗组分分析法来对葡萄 糖、谷氨酰胺、维生素和氨基酸等组分进行设计；也 可以通过化学计量分析法，建立培养基各组分与细 胞能量代谢、生物量或蛋白合成量之间的化学计量 函数，从而对基础培养基、补料培养基及补料策略进 行设计。

２．２．２ 分子生物技术法 分子生物技术法是以基 因组学和蛋白组学技术为依托的一种高通量的设计 方法。研究人员可以应用基因芯片、抗体芯片和双 向凝胶电泳等技术，在 ｍＲＮＡ 和蛋白水平上获得细 胞培养过程中关键基因或蛋白的变化情况，用以确 定培养基中调控这些基因或蛋白表达的成分的添加 类型和比例，进而调控细胞的生长、分化和凋亡等生 理指标［１４］。

２．２．３ 统计学实验设计法 统计学实验设计法是 通过在培养基的设计、优化及数据结果分析中运用 统计学方法，经济地获得可靠结果，并将误差降到最 低的一种设计方法。由于其省时省力，具有快速获 得大量参数的优势，近年来被广泛应用于细胞培养 及过程优化中，并取得了卓有成效的研究成果。如 ２０１０年Ｊｅｏｎ等人利用分式析因设计和响应面的统 计学方法对人 细 胞 毒 素 Ｔ 淋 巴 细 胞 无 血 清 培 养 基 中的卵磷脂、多 胺、抗氧化剂和胆固醇进行设计优 化，最终获得最高活细胞密度比有血清培养基高１．５ 倍的无血清培养基，而且其 Ｔ 淋巴细胞效应功能仍 然保留［１５］。

无血清培养基的应用

３．１ 生物制品和生物药物研制与生产方面的应用 目前，生产生物活性蛋白、疫苗、单克隆 抗 体 和 基因治疗药物的表达载体等生物制品时一般都采用 可高密度生长的动物工程细胞。无血清培养技术的 运用，给动物工程细胞提供了更优的生长条件，进而 表达更多的目的产物，并有利于后续目的产物的分 离和纯化，显 示 了 其 强 大 的 优 势。Ｋｕｔｓｕｚａｗａ等 在 研究新的３Ｄ 培 养 系 统 时 发 现，无 血 清 培 养 基 较 有 血清培养基可提高大约３倍的重组蛋白产量，使该 系统能更好 地 适 用 于 生 物 制 药 生 产［１６］。为 避 免 生 物制品的血清污染，Ｔｏｒｉｎｉｗａ等研究得到一种用无 血清培 养 基 生 产 Ｖｅｒｏ细 胞 源 乙 型 脑 炎 疫 苗 的 方 法，而且其疫苗可通过添加稳定剂（如山梨醇或甘氨 酸），实现在室温下储存［１７］。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ 等 利 用 ＣＨＯ 细胞生产单克隆抗体时发现，在无血清条件下 培养，就无血清培养基的基础培养基适应性进行了 对比评价，指出相比于 ＤＥＭＥ培养基，ＥＸ－ＣＥＬＬ培 养基更有利于单克隆抗体的生产，这为后续单抗的 研发生产奠定了良好的基础［１８］。Ｋｕｒｏｄａ等在研发 慢病毒载体 生 产 方 法 时，开 发 了 培 养 人 胚 肾 ＨＥＫ ２９３细胞的无蛋白培养基，从而获得了低成本、无批 次差异且高滴度的慢病毒载体［１９］。所以说，无血清 培养基清晰明确的成分以及完善的质控体系，使得 制备生物制品和生物药物的宿主细胞，在培养过程 中更加稳定，产物表达效率更高，产品质量更加安全 可靠。

３．２ 干细胞培养和研究方面的应用 干细胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＳＣ）是一类具有自我复制 能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多 种功能细胞，因此对其培养条件的质量控制成为关 键。目前，鉴于无血清培养基拥有明确成分的特性， 它已被 广 泛 应 用 于 干 细 胞 的 体 外 培 养 和 研 究 中。 Ｓｗａｍｙｎａｔｈａｎ等通过体外实验验证 ＭｅｓｅｎｃｕｌｔＴＭ间 充质干细胞无血清培养基相较有血清培养基，完全 可以为脐带来源的间充质干细胞提供体外大规模培 养所需的营养条件；无血清培养基培养的干细胞保 留了临床治疗所需要的干细胞特性，并且减少了因 血清带来的后续治疗中的潜在危险［１］。另 一 方 面， 研究人员不断开发新型无血清培养基，以提高培养 效率或者适用于不同诱导分化需求。Ｚｈａｎｇ等利用 含 有 ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＧＦ－１、ｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ５ 和 ＩＧＦＢＰ２等五种因子的无血清培养基可以使人脐血 造血干细胞（ＨＳＣ）在 体 外 生 长 速 度 提 高２０倍，为 临床应用提供培养条件上的支持［２０］。Ｐｉｃｋ等 则 开 发了一个无血清无滋养培养系统，他们利用该系统 成功从人胚胎干细胞分化获得可产生血小板样细胞 的骨髓巨核细胞，这使得人类朝干细胞诱导分化获 得治疗用人 类 血 小 板 又 迈 进 了 一 大 步［２１］。最 近 研 究报道，为了应对肠道组织天然干细胞来源不足的 问题，Ｍａｈｍｏｕｄ等开发出一种适宜肠道干细胞体 外增殖的无血清培养基，他们添加了乙醇胺、转铁蛋白、抗坏血酸磷酸盐、亚硒酸钠和谷胱甘肽等五种补 充因子［２２］。该成 果 对 于 基 础 研 究 和 临 床 应 用 均 具 有积极意义。

参考文献: [1]SwamynathanP,VenugopalP,KannanS,etal.Are serum-freeand xeno-freecultureconditionsidealfor largescaleclinicalgradeexpansionof Wharton′sjelly derived mesenchymalstem cells?A comparativestudy [J].StemCellResearch& Therapy,2014,5(4):88.

[2]郭纪元.CHO DG44稳定细胞株无血清培养基的研发 与优化[D].厦门:厦门大学生命科学学院,2014.

[3]Van der Valk J,Brunner D,De Smet K,et al. Optimizationofchemicallydefinedcellculture media- replacingfetal bovine serum in mammalian in vitro methods[J].Toxicologyin Vitro:AnInternational JournalPublishedinAssociationwithBIBRA,2010,24 (4):1053-1063.

[4]KeenMJ,RapsonN T.Developmentofaserum-free culture medium for the large scale production of recombinantproteinfromaChinesehamsterovarycell line[J].Cytotechnology,1995,17(3):153-163.

[5]LiY,PowellS,BrunetteE,etal.Expansionofhuman embryonicstem cellsin defined serum-free medium devoidofanimal-derivedproducts[J].Biotechnologyand Bioengineering,2005,91

(6):688-698. [6]Cardoso T C, Teixeira M C, Fachin N,et al. Evaluationofserum-andanimalprotein-freemediafor theproduction ofinfectious bronchitis virus (M41) straininacontinuouscellline[J].Altex,2005,22(3): 152-156.

[7]Spens E. Haggstrom L: Defined protein-free NS0 myelomacellculturesstimulation ofproliferation by conditioned medium factors [J]. Biotechnology Progress,2005,21(1):87-95. [8]Schroder M, Matischak K, Friedl P.Serum - and protein-freemediaformulationsfortheChinesehamster ovarycelllineDUKXB11[J].JournalofBiotechnology, 2004,108(3):279-292. [9]HuangY M,Hu W,RustandiE,etal.Maximizing 72 陕西师范大学学报(自然科学版) 第43卷 productivityofCHOcell-basedfed-batchcultureusing chemically defined media conditions and typical manufacturingequipment[J].Biotechnology Progress 2010,26(5):1400-1410.

[10]Zhang H, Wang H, Liu M, et al. Rational developmentofaserum-free medium andfed-batch processforaGS-CHOcelllineexpressingrecombinant antibody[J].Cytotechnology,2013,65(3):363-378.

[11]MikiH,TakagiM.Designofserum-freemediumfor suspensioncultureofCHOcellsonthebasisofgeneral commercialmedia[J].Cytotechnology,2014,DOI: 10.1007/s10616-014-9778-0. [12]RourouS,vanderArk A,vanderVeldenT,etal. Developmentofananimal-componentfreemediumfor verocellsculture[J].BiotechnologyProgress,2009, 25(6):1752-1761.

[13]王永民,陈昭烈.动物细胞无血清培养基的研究与设 计方 法 [J]. 中国生物工程杂志,2007,27(1): 110-114.

[14]HanMJ,LeeSY.Proteomeprofilinganditsusein metabolicand cellularengineering[J].Proteomics, 2003,3(12):2317-2324.

[15]Jeon M K,Lim JB,Lee G M.Developmentofa serum-free medium forinvitroexpansionofhuman cytotoxicTlymphocytesusingastatisticaldesign[J]. BMCBiotechnology,2010,10:70. [16]KutsuzawaK,TakahashiC,SatoR,etal.Multiarray formationof CHO spheroidscocultured withfeeder cellsforhighlyefficientproteinproductioninserum- free medium [J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology,2013,13(1):229-235.

[17]ToriniwaH,KomiyaT.Long-termstabilityofVero cell-derivedinactivated Japanese encephalitis vaccine preparedusingserum-freemedium[J].Vaccine,2008, 26(29/30):3680-3689. [18]Rodrigues M E,Costa A R,Henriques M,etal. Advancesanddrawbacksoftheadaptationtoserum- freecultureofCHO-K1cellsformonoclonalantibody production[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology, 2013,169(4):1279-1291.

[19]KurodaH,KutnerR H,BazanNG,etal.Simplified lentivirusvectorproductioninprotein-freemediausing polyethylenimine-mediatedtransfection[J].Journalof VirologicalMethods,2009,157(2):113-121.

[20]ZhangCC,KabaM,IizukaS,etal.Angiopoietin-like 5andIGFBP2stimulateexvivoexpansionofhuman cord blood hematopoietic stem cells as assayed by NOD/SCIDtransplantation[J].Blood,2008,111(7): 3415-3423.

[21]Pick M,AzzolaL,OsborneE,etal.Generationof megakaryocytic progenitors from human embryonic stemcellsinafeeder-andserum-freemedium[J].PloS One,2013,8(2):e55530. [22]Mohamed M S,Chen Y,Yao C L.A serum-free medium developedforin vitro expansion of murine intestinalstemcells[J].BiotechnologyJournal,2014, 9(7):962-970. [23]KajiroM,HirotaR,NakajimaY,etal.Theubiquitin ligaseCHIPactsasanupstreamregulatorofoncogenic pathways[J].Nature CellBiology,2009,11(3): 312-319. [24]PontiD,CostaA,ZaffaroniN,etal.Isolationandin vitropropagation oftumorigenic breastcancercells with stem/progenitor cell properties [J]. Cancer Research,2005,65(13):5506-5511.

[25]Ricci-VitianiL,Lombardi D G,Pilozzi E,etal. Identification and expansion ofhuman colon-cancer- initiatingcells[J].Nature,2007,445(7123):111-115.

[26]Bate-EyaL T,Ebus M E,KosterJ,etal.Newly- derivedneuroblastomacelllinespropagatedinserum- freemediarecapitulatethegenotypeandphenotypeof primaryneuroblastomatumours[J].EuropeanJournal ofCancer,2014,50(3):628-637.

[27]WangL,Huang X,Zheng X,etal.Enrichmentof prostatecancerstem-likecellsfrom human prostate cancercelllinesbycultureinserum-freemediumand chemoradiotherapy [J]. International Journal of BiologicalSciences,2013,9(5):472-479.

[28]BouwerAL,NetterP,KempR A,etal.Adefined serum-free medium useful for monitoring anti- melanoma responses induced by dendritic cell immunotherapy [J]. Journal of Immunological Methods,2010,352(1/2):178-181.

[29]FalknerE,ApplH,EderC,etal.Serumfreecell culture:Thefreeaccessonlinedatabase[J].Toxicologyin Vitro: An International Journal Published in AssociationwithBIBRA,2006,20(3):395-400.