技术专题 | 浅析细菌内毒素检测现状

细菌内毒素检测

细菌内毒素检测（BET）是制药和生物医学行业的基本安全要求。如果内毒素以足够的浓度进入患者的血液，可能会导致发热和感染性休克等有害症状，严重时可能致命。因此，任何进入人体的药物产品，包括非肠道药物和可注射装置，在投放市场之前必须进行内毒素检测。这些质量控制（QC）测试必须符合药典以及食品和药物管理局（FDA）实施的监管要求。

传统的热原检测定性方法是兔热原试验（RPT），它最早于20世纪初发展起来，其原理是热原性的非肠道药物（即被包括内毒素、病毒和霉菌在内的致热物质污染的药物）会引起兔体温的变化。然而，RPT是一种通用的热原检测方法，因此对细菌内毒素没有特异性。

鲎试剂（LAL），一种高灵敏，高特异性的内毒素检测方法，逐步取代RPT成为制药和生物制品的内毒素检测方法。

夕阳下的鲎↑↑↑↑

LAL来源于大西洋马蹄蟹（鲎）的血细胞，阿米巴细胞。阿米巴细胞形成鲎的免疫系统，当它们遇到内毒素（和其他病原体）时会产生凝结。通过这种原理，LAL试剂产生可靠、敏感和特异的BET分析。然而，由于部分样品中内毒素被遮蔽，LAL试剂可能会出现误检。这种所谓的低内毒素回收率（LER）现象是内毒素检测界目前正在解决的一个相关问题。

什么是细菌内毒素?

细菌内毒素结构↑↑↑↑

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）结构成分，由三个主要部分组成：O抗原、核心聚糖和脂质A，这是脂多糖中非常保守的成分。进入人体血液后，如果细菌细胞壁降解（例如由于免疫系统的作用），那么脂质A分子就会与TLR4受体相互作用。 

血液中脂质A的存在促进内皮细胞表达促炎细胞因子和组织因子，导致细胞凋亡。如果大量释放，脂质-A会导致患者内毒素感染相关的毒性效应，包括发热、腹泻、呕吐，以及可能致命的内毒素休克（败血性休克）。

细菌内毒素是肠外药品中最危险和最常见的致热污染物之一，其主要原因有以下四点：

1 它在自然界中无处不在（革兰氏阴性菌即使在干净的水中也能繁殖）

2 毒性强

3 在极端条件下也很稳定

4 生产过程中很容易引入

因此，在制药和生物医学工业中，对细菌内毒素进行可靠和有效的检测是必不可少的。任何标记为无热原或无菌的可注射或可植入产品在放行前必须进行内毒素检测。最成熟和最广泛使用的细菌内毒素检测方法就是LAL。

鲎试剂

在制药和生物医学行业中，患者安全和遵守监管标准至关重要。风险管理的一个关键方面是确保投放市场的任何非肠道药物和植入式装置没有被细菌内毒素的污染。作为当前cGMP和其他质量控制法规的一项基本要求，许多公司在整个生产过程中使用鲎试剂检测产品中是否存在内毒素。通常，公司也会在生产开始前对原材料进行内毒素检查，以达到设计标准的质量要求，并尽可能确保原材料中内毒素含量低或可忽略不计。

科学家正在使用LAL进行内毒素检测↑↑↑↑    

LAL法是一种可靠、灵敏、特异性强的内毒素检查方法，也是监管机构主要的推荐方法，应用广泛，包括药物制剂检测和短寿命放射性同位素的现场检测。

鲎试剂因为其鲎血来源的不同称谓不同，来源于美国东部沿海的称之为LAL，来源于东南亚和东亚的称之为TAL，通常来说LAL在世界范围内被认可，TAL主要在亚洲使用。

鲎试剂如何检测内毒素

BET试验最早于20世纪60年代出现，20世纪70年代LAL在美国商业化为细菌内毒素试验，它是用从大西洋马蹄蟹的蓝色血液中提取的血细胞，阿米巴细胞制作而成。这些阿米巴细胞是螃蟹唯一的免疫防御系统：凝血系统。在遇到包括内毒素在内的外来物质后，阿米巴细胞产生凝块，并杀死病原体。

即使是不到十亿分之一克的微量内毒素，也能触发这种免疫反应。这是通过一个复杂的凝血级联反应发生的，自从LAL分析首次发展以来，已经被广泛研究。这一级联反应中的第一种酶是因子C酶（生物传感器），它与脂多糖分子中的一种疏水脂类成分结合，引发一系列酶反应，从而形成血栓。鲎试剂检测利用内毒素敏感的凝血级联反应对样品中是否存在内毒素进行定性评估。自LAL试剂首次开发以来，通过改变LAL试剂的配方和分析方法，已进行了许多尝试，以提高LAL分析的灵敏度和效率。

岌岌可危的鲎与rFC

Lonza员工正在放生鲎↑↑↑↑    

由于LAL依赖于采集野生马蹄蟹的血液，保护全球鲎种群对于LAL的生产来说至关重要。在美国，多样的保护措施在确保可持续的鲎血采集方面取得了广泛的成功。然而，在亚洲，不规范的鲎血采集造成了野生鲎数量的急剧下降。

这对鲎的保护提出了严峻的挑战。内毒素检测界的一个关键问题是，随着全球人口的增长，制药和生物医学行业将需要为不断增长的医疗市场服务。这将增加对鲎试剂的需求，可能危及可持续的捕捞做法，并威胁到已经枯竭的马蹄蟹种群。因此，不依赖于鲎血的、新的BET法：重组C因子法（rFC）出现了。

四种主流内毒素检测方法

根据鲎试验的原理，建立了四种主要的细菌内毒素检查方法：凝胶法、比浊法、显色法和rFC法。这些都在非肠道药物和注射器械生产过程中的质量控制（QC）检测中有着重要的应用。比浊法、显色法和rFC法是定量的，而凝胶法仅可半定量，定性使用。

Lonza动态显色法       定量内毒素检测，可通过动态或是终点显色法进行内毒素检测。

Lonza凝胶法       半定量内毒素检测，最经典的方法，简单易行，无需酶标仪

Lonza动态浊度法          定量内毒素检测，更加经济，通过动态检测浊度的情况评估内毒素含量，尤其适用于水或是大体积干粉注射剂

Lonza rFC法        定量内毒素检测，不依赖于鲎血，无动物源，更加稳定的产品供应。

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