干细胞体外培养最新技术进展（2021年9月）

“干细胞”，指的是多细胞生物的未分化细胞，它具有产生更多相同类型细胞的能力。此外，适当激活干细胞，可以分化并产生多种类型的细胞。

如今，公认的哺乳动物干细胞有三大类。（1）全能干细胞，仅在早期胚胎中可以找到，可以生长为完整的生物体。（2）多能干细胞，它的潜在能力更受限制。它们出现在胚泡的内细胞团中，在成年个体中可以形成 200 多种不同的细胞类型。（3）专能干细胞，来源于胎儿组织、脐带血和成人干细胞。多年来，一直将它们用于治疗各种血液疾病。

在常规哺乳动物细胞培养中，生物反应器的使用已经很成熟，例如用于生产治疗性重组蛋白、疫苗和抗体。现有方案主要用于 100-1000 L 以及更大规模的哺乳动物细胞工艺开发和生产。

搅拌式生物反应器的细胞培养能够严格控制并实时监测所有相关工艺参数例如温度、搅拌速率、pH 或溶解氧，并进行放大。这一技术可用于建立满足 hPSC，包括人诱导多能干细胞 (hiPSC) 和人胚胎干细胞 (hESC) 需求的工艺。

现已有采用悬浮培养法培养贴壁干细胞的研究，这些研究主要为传统哺乳动物细胞培养 — 基质附着型 hESC 微载体培养的变式。

但是，由于未分化 hPSC 倾向于彼此粘附而不是粘附到预筛选的微载体上，因而可能产生培养异质性问题。近期的研究证明了通过悬浮法以细胞聚集物形式培养未分化人 ESC 和 iPSC 的潜力。

本篇我们将盘点近年来干细胞体外培养技术的研究进展和突破性技术：

【1】Cell ：重大突破！杜鹏团队实现全能干细胞体外稳定培养 

2021年5月14日，北京大学杜鹏团队在Cell 在线发表题为“Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression”的研究论文，该研究报告小鼠ESCs剪接体抑制驱动多能到全能状态转换。该研究使用剪接抑制剂Pladienolide B，可以在分子水平上与2细胞和4细胞卵裂球（称为全能卵裂卵球样细胞（TBLC））相比，在全能的ESC上实现稳定的体外培养。

该研究报告小鼠ESCs剪接体抑制驱动多能到全能状态转换。使用剪接抑制剂Pladienolide B，该研究可以在分子水平上与2细胞和4细胞卵裂球（称为全能卵裂卵球样细胞（TBLC））相比，在全能的ESC上实现稳定的体外培养。

作者还发现，在小鼠胚胎干细胞中，动态剪接体阻遏导致了广泛的内含子积累，从而导致多能性基因表达下降，而全能性基因仍然可以被有效地剪接并激活，这可能与全能性基因拥有短而少的内含子的独特基因特征有关，但是更详细的机制还需要继续探索。

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小鼠嵌合检测与单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合表明TBLC具有强大的双向发育能力，可产生多种胚胎和胚外细胞谱系。在机制上，剪接体阻遏导致多能基因的广泛剪接抑制，而几乎不含短内含子的全能基因被有效剪接并转录激活。该研究研究提供了一种捕获和维持全能干细胞的方法。

找到了体外全能干细胞稳定培养的方法，就能为体外进一步研究干细胞移植、体外器官培植和构建疾病模型等应用提供了更多的原材料，干细胞治疗又上一层楼！

原文：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00500-6

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【2】日本毛囊干细胞克隆技术新进展，即将临床试验！

2021年2月10日，关于毛囊克隆再生的新研究发表：Expansion and characterization of epithelial stem cells with potential for cyclical hair regeneration”。

由Tsashi Tsuji博士和Makoto Takeo博士领导的联合研究小组建立了一个培养系统，该系统能够在体外诱导毛囊的上皮干细胞，控制毛囊上皮干细胞形成毛囊的能力，可以使用少量毛囊增殖复制出大量的新毛囊。

在他们先前的研究中，已经开发了毛囊干细胞的三维培养方法并成功移植到小鼠皮肤。但是能使毛囊长期周期性再生的培养基仍是未知的。也就是说，克隆的毛囊移植后，可能仅仅经过一两个生长周期，毛囊就死掉了。这项研究则建立了一种培养方法，以扩增和表征具有周期性毛发再生潜力的上皮干细胞。

他们尝试了220多种培养条件，以研究细胞生长因子，低分子量化合物和培养支架材料的组合，这些材料涉及与毛囊上皮干细胞的维持和增殖有关的信号途径。结果，在含有Noggin的培养基（NFFSE培养基）中使用了atelocollagen凝胶，该培养基可抑制BMP信号、成纤维细胞生长因子（FGF），激活HH信号的SAG和表皮生长因子（EGF） 。当使用三维培养，它显露具有诱导毛囊器官的能力，表皮干细胞显示出最高的生长速率。如下图：

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a）一个毛囊隆突细胞的三维培养图像。b）培养第6天的各组的显微镜图像（左）和细胞增殖率（右）。在NFFSE培养基中显示出最高的增殖速率。C）毛囊上皮干细胞分布示意图。d）和e）培养前后干细胞标记物CD34和Itg 6基因表达的分析。在所有培养条件下，NFFSE培养基中表达量最高。

Tsuji博士的团队已经建立了具有毛囊再生能力的毛囊上皮干细胞的体外培养方法，能够成功地将毛囊中获得的干细胞扩增了4000倍，而毛乳头细胞在体外扩增了约100次，因此可以从一个毛囊中产生100个新毛囊。文章称：“我们在实现毛囊再生医学的临床应用方面取得了长足的进步。”

原文：Expansion and characterization of epithelial stem cells with potential for cyclical hair regeneration

【3】破除造血干细胞在体外扩大培养的障碍

2021年8月12日，美国加州大学圣地亚哥分校Robert A.J. Signer研究组发文题为Hsf1 promotes hematopoietic stem cell fitness and proteostasis in response to ex vivo culture stress and aging，发现在体外培养的造血干细胞中Hsf1因子可以促进其适应性以及蛋白质的稳态，从而能够破除造血干细胞在体外扩大培养的障碍。

 该工作鉴定发现了体外培养的造血干细胞蛋白质合成增加的具体分子机制，主要与Hsf1的核积累有关，正是Hsf1的异常造成了造血干细胞体外维持的缺陷。在培养基中添加增强Hsf1活性的小分子可以抑制蛋白质的合成，重新调配蛋白质稳态的平衡，该工作为体外大规模的培养提供了新的可能性。

原文：https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.07.009

【4】干细胞体外培养技术打突破！最新技术提升生产速度276倍！

2021年4月12日报道，干细胞制造的最佳成绩——6天内让细胞数量变成原先的37倍，实现10亿/周的人类诱导多功能干细胞（hiPSC）生产速度，近日，法国医疗公司TreeFrog打破了这一瓶颈，他们宣称已经把这两个数字分别提升到了276倍和150亿！

 而该技术飞跃，意味着医疗机构能够大批量生产高质量的人类诱导多功能干细胞（hiPSC），例如在一周内提供10000支制剂，这使得细胞疗法有望进军大众市场。

TreeFrog医疗公司之所以能实现这一突破，主要得益于仿生3D细胞培养技术的进步，TreeFrog医疗公司开发了模拟多功能干细胞微环境的C-StemTM技术，它结合微流体技术，能以每秒1000个胶囊的速度封装人类诱导多功能干细胞（hiPSC）。而每个胶囊中的干细胞会自主形成微组织，模拟体内干细胞微环境，以促进细胞快速且高质量地分裂。

TreeFrog医疗公司的联合创始人兼首席执行官Kevin Alessandri博士介绍：“这种仿生胶囊是一种可以让营养物质、气体和生长因子进出的多孔膜，能保护细胞微环境不受生产过程的机械应力影响。在细胞扩增时，同一生物反应器内的干细胞微组织会直接分化为可移植的功能组织单元。只需几分钟，就能打开所有胶囊，释放其中的细胞内容物。”

原文：World first: TreeFrog Therapeutics announces the production of a single batch of 15 billion iPS cells in a 10L bioreactor with exponential amplification of 276-fold per week. - TreeFrog Therapeutics I iPS-derived cell therapies

【5】Nature：重大进展！28天内在体外将造血干细胞的数量扩大900倍，让无需接受调理治疗的造血干细胞移植成为可能

2019年5月29日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation”。除了Nakauchi之外，另一名论文共同通讯作者是东京大学干细胞生物学副教授Satoshi Yamazaki博士。论文第一作者为斯坦福大学博士后学者Adam Wilkinson博士和东京大学高级研究助理Reiko Ishida。

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图片来自Nature (2019)，doi:10.1038/s41586-019-1244-x。

造血干细胞是骨髓中发现的稀有细胞。像其他干细胞一样，它们经分裂后能够产生更多的造血干细一个称为自我更新的过程---或者产生体内所有不同类型的血液细胞和免疫细胞的前体细胞---一个称为分化的过程。

人们早就知道，患有镰状细胞性贫血和白血病等免疫或血液疾病的人能够通过移植健康的造血干细胞来治愈。但为了让这种治疗起作用，受者自身的造血干细胞必须首先被杀死以清除这种疾病，从而为健康的造血干细胞在骨髓中定植腾出空间。

这种清除步骤，也称为“调理（conditioning）”，可以用化疗或放疗，或两者的组合来完成。然而，这种调理能够导致危及生命的副作用。这在儿童患者中尤其如此，他们可能在以后的生活中遭受生长迟缓、不孕和继发性癌症等副作用。重病或老年患者通常不能接受移植，这是因为他们无法忍受这种调理治疗。

原文：doi:10.1038/s41586-019-1244-x