撰文排版:刘佳
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名词解释
蛋白质组(Proteome)
定义:蛋白质组指的是在某一特定环境条件下,一个细胞、组织或整个生物体内所有蛋白质的总集合。这包括所有类型的蛋白质表达、变异、修饰和相互作用的全貌。
环境依赖性:蛋白质组的组成不是静态的,它会根据细胞的生长环境、发育阶段、疾病状态等因素而变化。例如,细胞在不同的环境压力下(如温度、pH值、营养供给等)会产生不同的蛋白质反应。
基因组
定义:基因组是指一个生物体内所有的遗传信息,包括DNA中的所有基因。基因组是相对固定的,不会因环境的改变而改变。
与蛋白质组的关系:基因组编码了生产蛋白质所需的信息,而蛋白质组是这些信息表达后的产物。因此,蛋白质组可以视为基因组功能的直接体现。
蛋白质组学(Proteomics)
定义:蛋白质组学是研究蛋白质组的科学领域。它不仅包括识别和定量生物体中所有蛋白质的种类和数量,还包括研究这些蛋白质的功能、结构和它们之间的相互作用。
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研究内容
1. 蛋白质的鉴定和定量
技术手段:最常用的技术是质谱技术,特别是液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。这种技术可以精确鉴定样本中的蛋白质,并进行定量分析。质谱通过测量蛋白质或肽段的质荷比(m/z)来识别分子结构。
应用:通过对不同样本(如疾病与正常组织、处理与未处理的细胞)的蛋白质表达水平进行比较,研究者可以识别出关键的生物标志物或病理状态下的蛋白质表达变化。
2. 蛋白质的表达谱分析
技术手段:使用如iTRAQ、TMT标签的定量技术允许同时分析多个样本中的蛋白质表达差异。这些技术通过标记不同样本的蛋白质,然后共同进行质谱分析,以比较它们的相对丰度。
应用:这种分析帮助研究者了解在特定生理或病理条件下蛋白质表达的全局变化,从而揭示疾病机理或生物过程的调控。
3. 蛋白质的修饰分析
技术手段:质谱技术同样是研究蛋白质修饰的关键工具。特定的富集技术(如抗体富集或亲和层析)常用于分离具有特定修饰的蛋白质或肽段。
应用:研究蛋白质如何通过磷酸化、乙酰化等修饰来调控其活性或与其他蛋白质的交互,这对于理解信号传导路径至关重要。
4. 蛋白质-蛋白质相互作用
技术手段:免疫共沉淀和质谱分析是常用的组合技术来研究蛋白质间的相互作用。此外,酵母双杂交系统也广泛用于发现新的蛋白质交互伙伴。
应用:这些研究有助于构建蛋白质交互网络,揭示蛋白质如何协同工作以执行复杂的细胞功能。
5. 蛋白质的结构分析
技术手段:X射线晶体学、核磁共振(NMR)和冷冻电镜是主要的结构生物学技术,用于解析蛋白质的三维结构。
应用:结构信息对于理解蛋白质的功能至关重要,特别是在药物设计和功能性生物材料开发中。
6. 蛋白质的功能注释
技术手段:除了生物化学实验外,基因敲除或敲降实验也常用于验证蛋白质的功能。
应用:功能注释帮助科学家理解蛋白质在生物过程中的具体作用,如酶催化、信号传递或结构支持。
7. 系统生物学和整合分析
技术手段:生物信息学工具和数学建模用于整合和分析来自不同组学的数据,如转录组学、蛋白质组学和代谢组学。
应用:这种整合分析有助于构建更全面的生物系统模型,提高我们对复杂生物过程的理解。
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研究流程
1. 样本准备
样本收集:根据研究目的选择合适的生物样本,如细胞、组织、体液等。
蛋白质提取:使用不同的提取缓冲液破碎样本,释放蛋白质,并通过离心等方法去除不溶物。
蛋白质纯化:根据需要可能包括盐析、透析、层析等步骤,以纯化蛋白质样品。
蛋白质量的量化:使用BCA、Bradford等方法确定蛋白质浓度。
2. 蛋白质消化
酶解:通常使用胰蛋白酶(如胰蛋白酶Trypsin)将蛋白质在特定位点(如赖氨酸或精氨酸后)切割成肽段,便于后续的质谱分析。
3. 蛋白质分离与鉴定
液相色谱:使用高效液相色谱(HPLC)等技术对肽段进行分离。
质谱分析:分离后的肽段被引入质谱仪,通过质谱分析进行鉴定和定量。常用的技术包括LC-MS/MS。
4. 数据处理和分析
数据采集:质谱仪输出的原始数据需要通过专门的软件进行处理。
肽段和蛋白质鉴定:使用数据库搜索引擎(如Mascot、SEQUEST等)匹配肽段质谱数据与蛋白质数据库,进行蛋白质鉴定。
定量分析:根据实验设计(如标记或无标记方法),进行蛋白质的定量分析。
生物信息学分析:进一步分析蛋白质表达数据,包括功能注释、富集分析、网络分析等。
5. 结果验证与功能研究
验证实验:通过免疫印迹、免疫荧光等技术验证关键蛋白质的表达。
功能性实验:如蛋白质过表达、敲除或敲降实验,以研究蛋白质的生物学功能。
6. 报告撰写与发表
数据整理:整理实验数据和分析结果。
撰写科研论文:将研究发现撰写成论文,提交至科学期刊发表。
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常见问题
1.筛选差异蛋白质/位点的基本原则是什么?
答案:没有统一标准, 但一般需要同时满足差异倍数和统计学分析双重过滤标准,如fold change>1.5以及显著性分析p-value<0.05。如果通过该标准筛选获得的差异蛋白质/位点数量较多,则可根据实际情况或者需求适当提高筛选标准,如fold change>2甚至>4或者p-value<0.01等。如果采用的实验设计为技术重复(质谱重复检测),可以通过计算出的标准差(SD值)预测理论差异倍数选择范围,一般选择2-3倍的SD值。
2.鉴定蛋白/位点很多, 但是差异蛋白/位点很少是什么原因?
答案:差异蛋白/位点我们一般选择的是差异倍数和p value两个维度进行卡值,一般差异蛋白/位点比较少存在两个可能,一个是p value比较大,组内差异大于组间差异,即样本收样过程中,同组样本处理的平行性不好,对于这种情况,可以考虑删掉一些PCA分析中明显离群的个别样本。第二,定量到的蛋白/位点在两组间差异倍数比较小,即两组样本的差异小, 两组样本本身差异不明显。
3.PCA 分析中同组样本没有聚在一起是什么原因?
答案:主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)通过对数据进行降维分析,从而检测实验组间的差异性及组内的重复性。PCA二维图中, 空间分布差异越小,表示两个样本的数据越接近。如果出现同组样本没有聚在一起的情况有几种可能:第一,有些样本本身的组内差异比较大,例如人的组织、血清、血浆、尿液、加药时间点处理的样本等;第二,样本不是同一批次收集,存在批次效应,或者样本收集步骤比较繁琐,实验误差导致了组内差异的出现,等等。
4.检测到的蛋白质unique peptide 是不是越多越好,peptide=1 的蛋白质定量结果是否准确
答案:检测到的蛋白质的unique peptide越多,蛋白质可信度越高。早些年发表的文章一般会认为unique peptide≥2的数据是可信的蛋白质定性数据。
但是随着现在质谱仪精度和分辨率的提高,对应高精度质谱仪(如Q-Exactive,AB5600等等)产生的数据,像MCP或者JPR这类蛋白质组学领域最好的杂志,也明确表示认可unique peptide=1 且对应图谱质量较高的数据,只是根据不同的杂志要求需要提交不同格式的图谱数据。
另一方面,对于定量unique peptide的数量,文章一般都没有要求。可以理解的是,对于只有一条肽段定量一个蛋白质的情况,蛋白质定量结果的准确性和可靠性会相对较低。通常情况下,通过设置生物学或者技术重复实验,根据蛋白质定量数据的平均值和统计学p-value值可以获得准确度和可信度较高的蛋白质定量结果。纯粹的一次质谱行为则不能反映其定量准确性。
5.质谱实现定性定量的原理?
答案:质谱的质量检测器可以理解为一个天平, 可以称量进入其中的离子的 m/z,蛋白经酶切后会形成多肽,多肽在质谱的离子源位置会带上正电荷,成为一级母离子飞进质谱的质量检测器,质量检测器输出一级谱图;接下来母离子还会在碰撞池的位置进行氨基酸的依次断键,再进入检测器,输出二级谱,经过与数据库生成的理论谱图匹配,可以判断肽段的氨基酸组成,然后再根据肽段反推出蛋白。一级和二级谱的峰值,根据定量原理的不同,均可以作为蛋白定量的依据。
6.蛋白质组样本质谱检测的上样量是多少?
答案:一般来说,如果是复杂样本,质谱上样量应是 0.5-1μg 左右,如果为IP或纯化后的蛋白样本, 这一类成分比较单一的样本,并不需要达到 1μg,只需要保证IP或纯化实验的操作成功,有明显的WB条带或者SDS-PAGE条带即可。
7.经 WB 检测,未检测到的蛋白,质谱可以检测到吗?
答案:WB未检测到的蛋白有些是由于蛋白本身表达量低,抗体难以识别到,也有些是于抗体本身效价低等原因。对于质谱而言,其识别目标蛋白的原理与抗体不同,其可以检测到低丰度的蛋白,但是低丰度的蛋白信号容易被高丰度蛋白掩盖掉,可能需要通过富集或者分流分等前处理方法提高目标蛋白的相对丰度,再进行质谱检测。另外,WB未检测到的蛋白不一定是因为丰度低的原因,也可能是因为抗体效价低、样本中蛋白提取不充分或存在杂带掩盖等原因导致的,需要具体情况具体分析。
8.没有全基因组测序的物种能否做蛋白质组学?
是可以的,目前已经有大量的物种完成了全基因组测序;未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究;如果没有较好的近缘物种也可以使用稍大一些的属或科的数据库进行检索。除此之外,如果研究人员做过转录组亦可以使用相关的数据建立本地蛋白质谱鉴定数据库。
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应用案例
1.疾病诊断和生物标志物发现
在医学研究中,蛋白质组学被用来识别与特定疾病相关的蛋白质,如癌症、心脏病和神经退行性疾病。通过分析疾病状态和正常状态下的蛋白质表达差异,研究人员可以发现潜在的生物标志物,这些标志物有助于疾病的早期诊断和治疗效果的监测。
2.药物开发
蛋白质组学技术可以用来研究药物作用的分子机制和药物的靶标蛋白,帮助开发新药或改进现有药物。例如,通过分析药物处理后细胞内蛋白质的变化,研究人员可以更好地理解药物的作用机理和副作用。
3.系统生物学和复杂疾病的研究
蛋白质组学是系统生物学的重要组成部分,它可以帮助构建生物分子网络和通路,从而揭示细胞内复杂的生物过程和疾病发生的分子基础。这种方法对于研究如癌症这样的复杂疾病特别有价值,因为癌症涉及多种基因和蛋白质的异常。
4.农业和植物蛋白质组学
在农业研究中,蛋白质组学被用来改善作物品质、增加抗病性和适应性。通过分析不同环境条件下作物的蛋白质表达,科学家可以培育出更适应特定环境的作物品种。
5.环境科学
蛋白质组学也应用于环境科学,例如通过分析环境污染对生物体蛋白质表达的影响,研究污染物的生物效应和生态风险。
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