免疫微环境、免疫细胞浸润分析、免疫功能分析

思路来源：
https://www.omicsclass.com/article/1437
https://www.bilibili.com/read/cv22219799/

1.肿瘤免疫微环境（TIME）

肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment）是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤和周围环境密切相关，不断进行交互作用，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。
对于免疫微环境有一个流行的学说——“种子与土壤”学说，肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与其微环境相互影响、共同进化的结果。肿瘤微环境由不同种类的间质细胞和炎性介质以及细胞外基质（ECM）组成。其中肿瘤相关成纤维细胞是最主要的间质细胞；血管内皮细胞介导的血管新生为肿瘤生长和转移提供必需的营养；免疫浸润包括树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞及不同亚型的T细胞等等。肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞可以通过分泌特殊的细胞因子形成正反馈循环促进肿瘤恶性表型的形成和维持。肿瘤微环境在肿瘤恶性进展、免疫逃逸和治疗抵抗中发挥重要作用,我们统计了近8年（截至2020.11）pubmed 收录的关于肿瘤免疫浸润的文章数目，可见一直呈增长趋势，热度未减。
肿瘤细胞和基质成分之间相互作用，形成了功能复杂的TME。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）主要分布于血管周围或肿瘤外周纤维间质内，分泌细胞因子、ECM成分及相关酶分子。TME中有多种免疫浸润细胞，其中CD8+或细胞毒性T淋巴细胞（CTL）发挥肿瘤杀伤功能，而调节型T细胞（Treg）减弱T细胞活性，促进TME免疫抑制。一般M1型巨噬细胞发挥促炎和抗瘤作用，但TME中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）为M2型，通过分泌Th2细胞因子促进血管生成和肿瘤侵袭。我们所熟知的NK细胞会释放颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞，但在TME中富集的TGF-β会抑制其杀伤活性。而树突状细胞（DC）也会受到TME中的缺氧和炎症影响消弱其抗原呈递活性。基质细胞类型和富集程度决定了TME特性，进一步影响着肿瘤进展和免疫应答情况。

2.TIME的免疫特点和相关机制

TME的异质性使得个体间肿瘤进展存在很大差异；肿瘤的免疫微环境一般分为豁免型和炎症型。炎症型肿瘤微环境中富集有活化的T细胞和髓系细胞，并由趋化因子、I型干扰素信号表达。相反“冷肿瘤”，既是免疫豁免型TME中，仅存在少量免疫细胞或抑制性亚群，如Treg、MDSC和TAM，而效应型免疫细胞无法有效浸润至肿瘤微环境。仅分布在外周基质，难以发挥抑癌作用。

3.免疫浸润的检测工具

肿瘤浸润情况对癌症治疗效果和患者预后有很大的影响，了解肿瘤微环境中免疫细胞的组成有助于揭示肿瘤异质性。利用RNA-seq技术进行基因表达谱分析可以表征肿瘤相关基因的表达谱，已广泛用于在许多癌症类型的研究。RNA-seq虽能提供基因表达信息，但并不能直接表征出免疫浸润情况，需要一定的算法进一步评估。

现有用于免疫浸润评估的算法可分为两大类：
（1）基于标记基因（marker gene）的肿瘤浸润免疫细胞量化方法；基于特征基因集的方法是通过使用组织样本中这些特征基因集的表达量，对基因集进行富集分析或将其汇总到丰度评分中来独立推断每种细胞类型的得分；其中代表的软件有TIminer、xCell、MCP-counter。另外还有一些评定免疫得分的软件如ESTIMATE；基于GSVA算法的ssGSEA，该方法将不同免疫细胞对应的marker genes作为基因集合, 采用类似GSEA的算法来评估样本中高表达的基因在不同免疫细胞的基因集合中是否富集。。

（2）基于表达特征对细胞混合物进行反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法。反卷积方法推断出数学方程式，该数学方程式是将组织样本的基因表达建模为种群混合物中细胞表达谱的加权总和。这两种互补的算法在估计不同肿瘤中特定的免疫细胞类型方面表现出不同的性能优势；相关软件有CIBERSORT、TIMER、EPIC、quanTIseq。

3.1.基于marker gene的ssGSEA富集分析的免疫分析方法

该方法将不同免疫细胞对应的marker genes作为基因集合, 采用类似GSEA的算法来评估样本中高表达的基因在不同免疫细胞的基因集合中是否富集。其代表性研究工具包括ssGSEA，xCell，MCP-counter，ESTIMATE等。

3.1.1.xCELL

xCell（http://xcell.ucsf.edu/ ）是基于 ssGSEA 的方法，可根据 64 种免疫细胞和基质细胞类型的基因表达数据进行细胞类型富集分析。Xcell 的输入文件是来自人类混合样本的基因表达矩阵（基因作为行，样本作为列）。如果基因表达数据来自微阵列，就不需要标准化。如果基因表达数据来自一个测序平台，数值必须被归一化为基因长度(例如，rpkm，tpm，fpkm)。Xcell 使用表达式级别排序，而不使用实际值，因此进一步的规范化不会产生影响。该方法适用于基因表达谱和RNA-seq数据，但不适用于单细胞数据。

作者：尔云间 https://www.bilibili.com/re