Computerized Calculation of Mitotic Count Distribution in Canine Cutaneous .. 笔记

Computerized Calculation of Mitotic Count Distribution in Canine Cutaneous Mast Cell Tumor Sections: Mitotic Count Is Area Dependent

犬皮肤肥大细胞肿瘤切片有丝分裂计数分布的计算机计算:有丝分裂计数与面积有关

摘要

有丝分裂计数（MC）是分级犬皮肤肥大细胞肿瘤（ccMCTs）的一个重要因素，它是在10个具有最高有丝分裂活性的连续高倍视野中测定的。然而，病理学家之间的区域选择存在差异。本研究分析了CCMCT中MC的分布和区域选择对MC的影响。两位病理学家独立注释了28个ccMCT（基本事实）的整个幻灯片图像中的所有有丝分裂图像。自动图像分析用于检查整个肿瘤切片区域中MC的基本ground truth分布，并与11位病理学家的手动MC进行比较。计算机分析显示不同肿瘤区域的MC具有高度的变异性。有6例MCTs持续低MCs（所有肿瘤区域MC<7），13例MCs大多高（10个高功率场区中75%以上为$MC<7$），9例MCs在7左右变化的边缘病例，这是ccMCT分级的临界值。在3个ccMCT组中，病理学家在确定有丝分裂像密度最高的区域方面存在不一致；只有51.9%的计数与最高25%的基本真值MC分布一致。无论如何，病理学家在检测$MC\ge 7$肿瘤方面有着实质性的一致意见。7以下的假低MCs主要发生在9例边缘病例中的4例（MC小于7的地方容易产生假病例），这些病例与$MC\ge 7$的ground truth对应区域很少。这项研究的结果强调了需要进一步标准化如何选择肿瘤区域来确定MC

引言

有丝分裂图的量化是兽医和人类肿瘤病理学中最常见的恶性肿瘤预测指标之一，人们普遍认为，核分裂象的数量越多，肿瘤的侵袭性越强。在用苏木精和伊红（HE）染色的标准组织切片中，对有丝分裂图像进行精确定量，已表明与人类乳腺癌快速扫描的主观印象相比，与预后具有更高的相关性。对于兽医病理学中的恶性肿瘤，建议通过有丝分裂计数（MC）来常规量化有丝分裂活性，MC是指10个连续非重叠高倍视野（hpf，放大400倍视野可见，视野数[FN]为眼球22，大小2.37 $m{m}^2$）中的有丝分裂图数量。对于某些肿瘤（如犬肥大细胞瘤，犬和猫乳腺肿瘤，犬黑素细胞瘤，犬软组织肉瘤），MC也是肿瘤分级的重要组成部分，MC的临界值已确定，直接影响肿瘤分级。例如，Kiupel等人开发的犬切割MCT（ccMCT）分级使用10 hpf中7个有丝分裂图的临界值作为ccMCT分级的标准之一。以前的分级系统使用了10的MC临界值。其他人建议完全基于MC，使用5或7的临界值来预测ccMCT。

MC非常适用于常规外科病理学，无需任何专用设备即可在玻璃和数字载玻片上进行测定。先前的研究表明，无论是通过光学显微镜还是数字显微镜，在犬圆细胞肿瘤和人类乳腺癌中，MC都有很强的一致性。然而，MC在观察者之间的不一致方面有一些限制。对人类乳腺癌犬乳腺癌和犬圆细胞瘤的几项研究表明，观察者之间和观察者之间通常存在高度的MC变异。令人惊讶的是，上面提到的许多研究都没有将hpf定义为400倍放大的视野。Meuten等人提出，兽医病理学的标准FN为22 mm，随后的hpf面积为400倍放大$0.237m{m}^2$。同样，当在计算机屏幕上观看数字整张幻灯片图像时，显示区域在很大程度上取决于显示器的对角线大小。标准化的进一步尝试是通过列举的hpf中的肿瘤组织比例来纠正MC。的确，面积大小的标准化已被证明在一定程度上改善了MC的一致性，正如在犬圆细胞肿瘤中所证明的那样，一致性相关系数增加了0.044（非标准化：0.648；标准化：0.592），人类乳腺癌的变异系数增加了3.7%（传统方法为56.0%，体积校正方法为52.3%）

另一个影响因素是观察者之间在识别单个有丝分裂图以及将其与坏死细胞等其他细胞结构区分开来的能力方面存在差异，尤其是在前期有丝分裂图像的情况下。很少有关于人类乳腺癌的研究报告称，观察者之间在决定单个细胞结构是否代表有丝分裂图方面只有轻微到中度的一致性（k=0.13–0.57）或6.9%到54.5%的不一致。适当的样品固定和载玻片制备，包括切片厚度，可能会对有丝分裂象的识别产生影响。在兽医或人类病理学中，观察方式（即光学或数字显微镜）对单个有丝分裂像识别的影响尚未得到充分评估。

重要的是，评估的hpf的选择标准不规范，选择标准模糊。因此，我们假设可变区域选择可能是影响MC的另一个因素，无论肿瘤类型如何。大多数分级系统和一般建议都要求在一个由10个相邻、不重叠的hpf组成的区域内计算有丝分裂图，这些hpf位于有丝分裂活性最高的肿瘤区域。面积为$4.0c{m}^2$的肿瘤切片包含1600多个非重叠的标准大小hpf。因此，扫描肿瘤切片并选择一个MC最高的区域可能有问题。一些研究通过计算随机选择的hpf中的有丝分裂图来绕过这个问题。其他研究选择肿瘤中细胞最多或最不易分化的部分，并排除坏死、出血、，以及其他人工因素。还建议在肿瘤周围进行MC，因为这是侵袭性前沿和最理想的固定材料。尽管迄今为止没有兽医病理学的系统研究，一些作者推测，可能更具侵袭性的肿瘤细胞可能更具增殖性，位于肿瘤的侵袭前沿。

在这项研究中，我们假设有丝分裂图形在CCMCT中不是随机分布的，并且任意选择计数区域将影响MC。为了验证这一假设，2名病理学家对28例不同CCMCT的HE染色组织切片的整个幻灯片图像中的所有有丝分裂图像进行了注释。随后，我们使用自行开发的自动图像分析软件系统地分析了整个肿瘤切片中有丝分裂图的分布情况（该软件确定了在肿瘤的每一个可能的10 hpf区域中有多少由2名病理学家标记的有丝分裂图像；我们没有使用人工智能来识别有丝分裂图形）。11位解剖病理学家手动执行的MC与计算机化的基本真相MC分布进行比较，以确定病理学家如何成功确定最高MC。此外，这项研究还验证了这样一个假设，即与肿瘤中心相比，肿瘤周边有丝分裂像的密度更高。

材料和方法

从作者的档案中随机选择了32例组织质量可接受的CCMCT，包括16例低等级和16例高等级CCMCT（根据原始诊断为2级分级系统；所有高等级病例均为$MC\ge 7$），组织质量合格（根据细胞细节的组织学可感测性确定）。随后，我们从系统分析中排除了4例肿瘤截面积$<12m{m}^2$的病例。这4个ccCMT包含很少的有丝分裂像（整个肿瘤切片中有1-5个有丝分裂图，最高可能的MC为1或2），因此，被认为不适合计算MC分布(范例热图在供应。图S1和S2)。

图1概述从注释数据导出幻灯片上的处理链、ground truth分裂计数分布。（A） 犬皮肤肥大细胞瘤（苏木精和伊红[HE]，病例20，第3组）的原始整张幻灯片图像，有核分裂图注释（绿点）和肿瘤边界注释（实线红线）。（B） 根据有丝分裂图注释得到的下采样（分辨率降低）有丝分裂图像图。（C） 有丝分裂计数图，表示在2.37 $m{m}^2$（即10个高功率场[hpf]）的规定区域内为整个幻灯片图像中的每个可能的中心坐标测定的有丝分裂数。颜色越亮，有丝分裂计数越高。（D） 下采样的二值肿瘤区域图源自肿瘤边界注释。（E） 从肿瘤区域图中导出的有效肿瘤区域图，不包括10 hpf区域窗口的中心坐标被肿瘤组织覆盖小于95%的组织。原始肿瘤边界用红色虚线表示。（F） 结合整个幻灯片图像（HE）的可视化，原始肿瘤区域内的有丝分裂计数图（绿色叠加；较高的不透明度等于较高的有丝细胞计数），以及黑线表示的有效肿瘤区域。要求每个10 hpf区域窗口的中心位于黑线内。在这个例子中，有丝分裂计数范围从0（蓝色10 hpf区域窗口）到105（红色10 hpf区窗口）。

在常规诊断服务中，MCTs采用福尔马林固定，沿其最大和正交直径切片，石蜡包埋。在本研究中，我们为每个病例制备了单个代表性组织块的新组织切片，随后用组织染色仪(ST5010 Autostainer XL； Leica, Wetzlar, Germany)。所有的幻灯片都用线性扫描仪(ScanScope CS2; Leica)在一个焦平面默认设置下扫描放大倍数为400倍，导致图像分辨率为0.25 um /像素。用Aperio ImageScope(Leica生物系统成像)软件的尺子工具在整片图像中测量28例患者最大的组织病理学肿瘤直径，范围为5mm ~ 28mm(平均:17.3 mm；表S1)。由于不能对所有病例进行大体测量，因此必须从数字化切片中确定肿瘤直径。使用SPSS Statistics 25 for Windows (SPSS, Inc，一家IBM公司，芝加哥，伊利诺斯州)，通过 2-sided t检验计算后定义的3组间最大肿瘤直径的统计学差异。

肿瘤面积和有丝分裂的注释

开源软件包SlideRunner用于2个注释任务(图1A)。首先，2名病理学家在整个幻灯片图像中标记有丝分裂图像。最初，第一个病理学家对完整的切片进行了两次肿瘤切片内所有有丝分裂图像的筛选(C.A.B.)。筛选工作以半自动的方式进行，软件会在放大倍数为400倍的情况下提出部分重叠、连续的图像部分，以确保完整的整张幻灯片图像被彻底查看。作为我们注释过程的一部分，许多非有丝分裂细胞(如肥大细胞、嗜酸性粒细胞和其他细胞结构，如凋亡细胞)被注释为不同的注释类。我们认为这是减少第二个注释任务的确认偏差的一种重要方法。然后，第二个病理学家(R.K.)被要求为所有最初注释的结构分配第二类(即，有丝分裂的图形或无丝分裂的细胞)，这些结构对第一个病理学家给出的细胞类别是盲的。第二意见注释也是以半自动化的方式进行的，软件显示的初始注释掩盖了之前分配的类别，直到幻灯片上的所有注释都给出了第二意见。两位病理学家都被要求只标记令人信服的有丝分裂图像。具有胞质分裂的末期图被标记为单个有丝分裂图。在28张全片图像中，至少有2位病理学家将52295个细胞结构注释为有丝分裂图。其中，43 421个细胞结构(83.0%)被两名病理学家同意为有丝分裂图，并被纳入ground truth数据集以作进一步分析。Ground truth是图像分析中标记数据集的术语，描述由定义的黄金标准方法确定的图像信息——在本例中，是由两个病理学家一致同意的人工注释的图像位置(坐标)和注释类(即有丝分裂图)。剩下的8874个有丝分裂-注释(17.0%)， 2位病理医师对细胞结构是否为有丝分裂图存在分歧，后续研究忽略这些注释。此外，共有152 866个注释被一致标记为非有丝分裂细胞结构。

其次，在整个组织切片中的肿瘤切片区域由一个病理学家(C.A.B.)使用多边形标注工具包围。该肿瘤区域图包括整个肿瘤区域，排除坏死区域;肿瘤区域内大于1hpf的非肿瘤组织，如大血管或被包裹的残余组织(皮脂腺、毛囊);并且，在一种情况下，一个模糊的图像部分(扫描工件)。3例(病例7、病例16、病例22)，肿瘤切面内出现细胞变化的区域。

有丝分裂计数图的生成

计算机图像分析用于确定人工标记的有丝分裂图在有效肿瘤区域内的分布。为此，根据有丝分裂图和肿瘤区域注释创建了不同的图像映射。首先，使用32的下采样因子创建了一个缩小尺寸的地面真值有丝分裂图注释的数字地图(图1B)。在这个二进制有丝分裂图中，每个有丝分裂图的中心被赋值为“1”，其他坐标赋值为“0”。结果是一个地图，包括了所有单个有丝分裂事件在各自的下采样坐标，降低了通常非常大的原始整张幻灯片图像的计算复杂。

在第二步中，我们使用滑动窗口求和来评估幻灯片中特定区域内有丝分裂图的数量。该肿瘤区域被指定为相邻10个标准大小的hpf的连续区域，每个hpf的跨度为$237m{m}^2$, Meuten等人推荐。最终的窗口覆盖总面积为$2.37m{m}^2$，以各自的坐标为中心，宽高比为4:3，宽/高为1777.6/1333.2微米，或在原始扫描分辨率下分别约为7110/5333像素。如上所述的下采样，窗口的大小被缩小到222 * 167像素。我们决定使用4:3的矩形来表示10-hpf的区域，因为数字显微镜(计算机屏幕)的观察区域是矩形的，而不是光显微镜的圆形。对于下采样的有丝分裂图图的每个像素位置，以该像素位置为中心设置一个指定大小的帧，并计算该帧内所有有丝分裂图的总和。滑动窗口求和得到的有丝分裂计数图包含了给定任意10-hpf区域中心坐标的所有可能的有丝分裂计数(图1C)。换句话说，有丝分裂计数图的一个像素代表10-hpf区域内的MC，它是该区域的中心坐标。上述步骤已被复制的定义区域20 hpf (4.74 mm2)和50 hpf85毫米(11)。

总结：

作者再次说明不同区域的选择影响有丝分裂计数，而专家也很难完成这一工作，我们当前算法的灵敏度和特异性不够高（F1得分：0.66–0.89），全自动有丝分裂活性评估在临床应用中仍有局限性；但可以通过研究整个幻灯片图像中的每个像素来改善有丝分裂图的组织病理学定量，从而减少区域选择偏差。

我们的研究结果强调了在定量ccMCT扫描切片中的有丝分裂图时需要进一步标准化。使用自动图像分析和深度学习方法的计算机辅助诊断系统可能是一种有希望的解决方案，可以准确和可重复地识别大肿瘤切片中具有最高有丝分裂活性的区域。