一文读懂5R微生物多样性（医学）高通量测序服务策略

微生物在癌症形成等方面的作用长期有争议，近期的研究表明细菌、病毒和真菌在癌症中普遍存在且是免疫治疗关键，但肿瘤组织中微生物含量低、能直接引发致癌作用的数量稀少，描绘肿瘤微生物组特征存在较大挑战。美格基因6月28日上线的5R微生物多样性（医学）高通量测序分析服务，适用低微生物量样品检测，助力研究人员阐释肿瘤微生物组特征和功能。

产品介绍

5R微生物多样性（医学）测序服务是通过对16S rRNA基因上的特定区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序，来实现对微生物物种的高覆盖率和高分辨率检测。与常规V3V4区扩增策略相比，此方法扩增出的区域覆盖约68%的16S全长序列，可以大幅提高细菌物种检测的覆盖率和分辨率，尤其适合于低微生物量的样品检测，有效降低了组织中宿主DNA对细菌16S rDNA扩增的严重干扰。5R 16S测序技术在医学领域具有广泛的应用前景，特别是在肿瘤微生物组的研究和临床应用方面展现出巨大的潜力。

图1. 多重5R PCR扩增区域

表1. 5R 16S测序与常规16S测序比较

技术优势

• 覆盖区域长

测序覆盖了16S rRNA基因上的5个区域，约占全长的68%。

• 鉴定“种”多

更长的16S rRNA基因覆盖，鉴定出更多更准的菌“种”。

• 检测灵敏度高

适用低微生物量样本如肿瘤组织的菌群检测。

• 样本宽容度大

适用降解样本中的菌群检测。

医学领域的应用

• 肿瘤疾病的诊断
• 肿瘤疾病的发生机制研究
• 肿瘤疾病预后研究
• 药代动力学研究

技术流程

（1）样品收集：适用于低微生物量的样品，例如组织、FFPE等。

（2）核酸提取：获得原始实验样品后，对样本中的微生物总DNA进行提取。

（3）5R 16S多重扩增：样品16S rRNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增。

（4）扩增产物回收纯化：对多重扩增后的DNA样品进行回收纯化。

（5）上机测序：对下机后的数据进行质控，质控合格后，再进行生信分析。

（6）数据分析：采用Short MUltiple RegionsFramework (SMURF)，通过整合分析5个扩增区域的序列，进行细菌的分类学鉴定。

图2. 技术流程图

分析流程

首先，采用Short MUltiple RegionsFramework (SMURF)，通过整合分析5个扩增区域的序列，进行细菌的分类学鉴定。其次，过滤、去除来自样本采集、DNA提取、PCR扩增等环节中引入的污染菌（阴性对照数据）。最后，基于过滤后的菌群数据，开展组内和组间的菌群多样性分析、差异菌群分析等。

图3. 分析流程图

文章案例

• 案例（一）

英文标题：The human tumor microbiome is composed of tumor type–specific intracellular bacteria

中文标题：人类肿瘤微生物组由肿瘤类型特异性细胞内细菌组成

发表期刊：Science

发表时间：2020

样本类型：冻存组织和FFPE样本

本文对肿瘤微生物组进行了全面分析，研究了7种癌症类型的1526个肿瘤及其邻近正常组织，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌和脑瘤。研究发现每种肿瘤类型都有不同的微生物组组成，乳腺癌的微生物组特别丰富多样。肿瘤内细菌主要是细胞内的，存在于癌症和免疫细胞中。研究还注意到肿瘤内细菌或其预测功能与肿瘤类型和亚型、患者吸烟状况以及对免疫治疗的反应之间的相关性。

图4. 人类肿瘤中检测到细菌成分

• 案例（二）

英文标题：Breast cancer colonization by Fusobacterium nucleatum accelerates tumor growth and metastatic progression

中文标题：核梭杆菌定殖乳腺癌加速肿瘤生长和转移进展

发表期刊：Nature Communications

发表时间：2020

样本类型：乳腺肿瘤组织

核梭杆菌是一种口腔厌氧菌，在人类结肠直肠癌中普遍存在且与不良治疗结果相关。本研究发现，人类乳腺癌进展时Gal-GalNAc水平增加，乳腺癌样本中核梭杆菌gDNA的出现与高 Gal-GalNAc水平有关，该细菌能与乳腺癌样本Fap2依赖性结合，可被GalNAc抑制。血管内接种表达Fap2的核梭杆菌ATCC 23726可定植小鼠乳腺肿瘤，而Fap2缺陷细菌定植受损。接种核梭杆菌抑制肿瘤浸润T细胞积累，促进肿瘤生长和转移，抗生素治疗可抵消。因此，靶向核梭杆菌核酸或Fap2可能对乳腺癌治疗有益。

图5. 核状芽孢杆菌ATCC 23726对乳腺癌的依附是Fap2介导的和Gal-GalNAc依赖性的