prottest

本文重点总结使用MUSCLE，ProtTest以及PhyML对蛋白序列进行构树的一般步骤，所涉及软件可能也适合核酸序列，在此不做讨论

   A phylogenetic tree or evolutionary tree is a branching diagram or 'tree' showing the inferred evolutionary relationship among various biological species or other entities based upon similarities and differences in their physical and/or genetic characteristics. The taxa joined together in the tree are implied to have descended from a common ancestor (Phylogenetic tree - Wikipedia).

  Phylogenetic tree, 进化树、演化树、系统树、系统发育树、系统发生树……非专业人士，不敢妄言哪个称谓最确切，留待专业人士解答吧~

  对于建树而言，通常分为三步：

  1）多序列比对（Multiple Sequence Alignment）；

  2）树的构建

  3）对所建树的评估

1.多序列比对

  多序列比对是建树的基础。可用于多序列比对的软件很多，如ClustalX，ClustalW，MEGA，MUSCLE等。各软件的特点在分子进化树的构建方法一文中有细致的描述，可能该文年岁有点久，难免有些许瑕疵，比如建ML树是需要做多序列比对的，MEGA现在也可以用于ML树的构建。当然这篇文章总结还算比较周全的。

  在讲MUSCLE之前对MEGA多提几句。MEGA为图形化界面的傻瓜软件，可提供多序列比对、进化树构建、评估、图形编辑一条龙服务，对于初学者或简单建树而言最为方便快捷，当然伴随的缺点就是许多参数不可控，只能被动接受软件给出的结果。

  MUSCLE is one of the best-performing multiple alignment programs according to published benchmark tests, with accuracy and speed that are consistently better than CLUSTALW.

  MUSCLE要求输入的文件格式为fasta格式

  通常多序列比对都涉及到accuracy和speed的问题，实际上对MUSCLE而言两者所用时间相差并不大，最多几十秒的差别，所以选择最accurate的设置即可。而MUSCLE默认的设置即以accuracy最高为标准

  MUSCLE输出结果可以有多种格式（interleaved phylip，sequential phylip，fasta<默认>）供选择，这需要我们根据实际需求选择，因为在使用PhyML构树时需要指明所用phylip格式是interleaved还是sequential的。我用的interleaved.

  用MUSCLE做比对的命令如下：

$muscle -in prosequence.fasta -phyiout prosequence.phy #muscle是经重命名得到的，如此做的目的仅是为了书写命令方便。本例输出的文件即为interleaved phylip格式，若用-out，输出默认的fasta格式，若用-physout，则输出sequential phylip格式

  更多命令见MUSCLE command-line option reference。

  注：用MUSCLE作比对输出的phylip格式文件中，序列名称仅保留前10个字符，后面的会被cut掉，因此特别注意的是，最终形成的每一个序列名称必须是独一无二的，不能出现重复。

2.树的构建

  建树工具也有很多，比如PHYLIP，Tree-puzzel，PAUP，PhyML等。本文仅关注PhyML。

PhyML有网页版和软件版两种运行方式

  用PhyML建树涉及到模型的选择和许多参数的设置问题。在建树之前最好用ProtTest测试哪种模型最适合当前的数据。

1）ProtTest的使用（详见Manual）

  在对DNA建树前需要用到ModelTest检测合适的模型，ProtTest可以看成ModelTest的蛋白兄弟版。

  ProtTest有图形界面版、命令行版和网页版。我的mac无法直接打开.jar文件，因此只能用命令行运行，所用命令为：

  $ java -jar prottest-3.3.jar -i prosequence.phy -o modeltest_prosequence.txt -S 1 -AIC -I -G -IG -F -ncat 8 -all

  # java -jar prottest-3.3.jar即为调用命令，跟manual不一样，按照manual的写法我运行不了；

   -i 为输入的文件名，即多重比对得到的那个结果 -o 为输出的结果

   -S 为运算策略，fast为0，slow为1，同样的slow会更精确些

   -AIC指用于排序的framework，除AIC外还有AICc，BIC，DT等

   -G -I -IG -F 为几种策略，我觉得做model检测的时候就全选上吧，试一试到底哪个好

   -ncat 8 指的是8个rate category，PhyML建树的时候也会设置这个参数，个人感觉此处应该跟PhyML所用的参数一致，默认值为4，在一定范围内越大越好，但是会有个阈值，有人用6，我用的8

   -all 会汇总各个frameworks的排序结果

(AIC详细结果，LG+I+G+F为最适模型，此为-AIC得到的)

（不同frameworks下各模型的排序，括号里数字为顺序，外面为概率。此即为-all得到的）

  最终我们选择了LG+I+G+F模型，这时需要去找该模型对应的参数

注：gamma shape即为PhyML建树时用到的Gamma distribution parameter，将其fix为0.97

     proportion of invariable sites在PhyML也有对应的选项，fix为0.019（在PhyML里最终会保留为0.02）

      aminoacid frequencies不知是否需在PhyML中改，没找到相应的设置，可能在PhyML中该选项选为empirical即是，此处不太确定。

2）PhyML建树（详见Manual）

  PhyML建树主要涉及以下四个方面参数的设置：

  其中Substitution Model的设置即需要用到ProtTest的结果

  具体设置如下：

1】Input Data

  输入左边的字母或符号，Enter之后，即可对右边的参数进行修改，根据实际情况选择数据类型；设置完毕后输入+，再Enter即进入下一个sub-menu

2】Substition Model

  此处的参数根据ProtTest结果进行设置，本例中最佳模型为LG+G+I+F，因此model选LG，proportion of invariable sites（I）定为0.02；Gamma distribution parameter（G）定为0.97；Animo acid frequencies（F）选empirical？Number of substitution rate categories用8，只要不小于4就行，大了更好些，也无需太大。

3】Tree Searching

  这样选应该就可以了

4】Branch support

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  Bootstrap analysis次数不能太少，用1000次得到的结果可能更准确。设置完成后检查一遍，提交即可开始运算，可能需要10几20个小时吧~

  此步可以认为是大步骤（3）：对所建进化树进行评估。

  运算结束后会生成多个文件：

  第一个.txt文件为最终的树文件，可以用TreeView进行查看、编辑，至此大功告成了。TreeView在Mac上又没装好，哎~

command line

phyml -i <inputfile> -d aa -b -3 -f e -v e -s BEST -o tlr --no_memory_check

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