生物标记钙卫蛋白在RA诊疗中的应用研究

标签: 类风湿关节炎; 预测因子; 钙卫蛋白; S100A9

[文献摘记]生物标记钙卫蛋白在RA诊疗中的应用研究

电邮发布日期:2016年4月20日

不断提升精确度和应用范围的组学技术正在帮助包括类风湿关节炎(RA)在内的自身免疫性疾病逐步接近理想的个体化治疗。组学技术的日新月异，为RA提供了很多候选生物标记，但由于还未经过严格检验，所以目前几乎没有已投入常规临床应用且有明确的疗效预测、疗效监测或预后预测应用价值的生物标记。主要由粒细胞和单核细胞产生的钙卫蛋白(calprotectin)是一种非疾病特异性的炎症相关蛋白，在关节炎的滑液以及外周血中高表达。目前已知钙卫蛋白参与多种自身免疫性疾病的发病，近年研究又提示它对RA的预后以及药物疗效有预测作用。

一、简述钙卫蛋白

钙卫蛋白是由钙结合蛋白S100家族的S100A8和S100A9组成的异二聚体，高表达于粒细胞和单核细胞。由于表达于髓系细胞，S100A8和S100A9又被分别称为髓相关蛋白MRP8和MRP14。钙卫蛋白在炎症的发生局部被大量释放。钙卫蛋白作为TLR-4配体参与多种自身免疫性疾病的发病,包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)以及炎性肠病(IBD)等(1)。

二、英国Scott教授的一篇系统性综述

英国伦敦国王学院医学院David L Scott教授等学者于2015年发表一篇系统性综述,汇总了钙卫蛋白在类风湿关节炎（RA）诊疗中的应用研究进展(2)。研究者从发表于1988年至2013年期间的270篇相关文献中遴选了17项符合预设条件的论文。这些研究的样本量大多数较小（中位数43例，范围：11-170例）。重要发现摘录如下。

1. 外周血与滑液表达水平

（1）16项研究报道了钙卫蛋白外周血表达水平，共计23种患者群（n=1051）。RA患者表达水平高于对照组。血清与血浆表达水平无明显差异。不同研究所报道的外周血表达水平有显著差异。ELISA检测法的批次内预期CV值通常为5%，而实际观察到钙卫蛋白血浆检测CV值范围为70%至超过200%，血清检测CV值范围为15%至超过200%。研究者推测，除了不同研究所用ELISA检测法有所不同，批次内的异质性最有可能反映不同患者表达水平的变异性，这可能提示了不同疾病活动度的差异。

（2）5项研究报道了钙卫蛋白在关节滑液的表达水平，总计112例患者。不同研究之间以及同一研究内均有显著的变异性，有的检测CV值很高（超过400%），有的则较低（13%至59%）。有3项研究称钙卫蛋白滑液表达水平与外周血有显著相关性，而在对照组的骨关节炎和脊柱关节炎患者中未见这种相关性。有4项研究都发现RA患者滑液钙卫蛋白水平高于对照组骨关节炎。

2. 与临床和实验室指标的相关性

（1）钙卫蛋白外周血水平与常规实验室指标的相关性通常高于与临床参数的相关性，其中相关性最高的是CRP（r=0.80）和ESR（r=0.70）。有一项涉及61例极早期关节炎患者的研究揭示钙卫蛋白在1年内的平均水平与CRP、ESR、RF和抗CCP呈显著相关性，校正性别、年龄和病程后显示钙卫蛋白与IgM-RF和抗CCP显著相关。但这种相关性未在另一项样本较小的研究中得到验证。

（2）RF阳性RA患者的钙卫蛋白外周血水平高于RF阴性者。一项随访10年的研究显示，IgM-RF、IgA-RF或抗CCP阳性者在基线和随访过程中的钙卫蛋白水平高于上述血清学指标阴性者。

（3）有2项研究显示钙卫蛋白表达水平与DAS28强相关（r=0.60，r=0.55）。另一项研究发现在多个血清学指标中仅有钙卫蛋白与SJC（r=0.24）、握力（r=-0.22）、PIP周长（r=0.33）以及病情全面评估（r=0.24）有显著相关性，而未发现CRP、ESR和RF各自单独与这些临床指标的相关性。

（4）一项涉及145例RA患者的横断面分析显示钙卫蛋白与van der Heijde改良Sharp评分（mTSS）以及类风湿关节炎关节损伤评分（RAAD）有显著相关性，这种相关性却未见于CRP或ESR。

3. 钙卫蛋白对治疗的反应以及对疗效与预后的预测作用

（1）一项针对124例RA患者的10年随访研究显示钙卫蛋白与RA关节损伤进展有相关性。在校正性别、CRP、ESR和抗CCP之后,多元回归分析显示基线钙卫蛋白水平仍与Sharp总评分自基线进展以及RAAD分值之间有显著相关性。而另一项56例患者的5年前瞻性随访研究并未发现钙卫蛋白对放射学进展(Larsen评分)有预测作用，但综述者注意到这组患者病程较长（中位数7.8年），可能会带来放射学进展较少的偏倚。

（2）一项20例患者接受TNFi治疗1年的随访研究揭示，在临床和实验室指标中，钙卫蛋白独立与关节超声总评分相关，而且对治疗反应的变化也高于CRP、ESR和血清淀粉样蛋白A。

（3）该综述罗列5项研究揭示钙卫蛋白对药物治疗的反应(表1)，治疗药物既有传统DMARD，也有生物制剂(TNFi和抗CD20)。尽管这些研究大多样本量小，总体趋势是一致的。以样本量最大(n=170)的一项研究为例，钙卫蛋白基线水平与临床参数基线值(SJC68、DAS28、ESR及CRP)有相关性；短期(16周)治疗有效者的钙卫蛋白降幅最显著；治疗有效者钙卫蛋白基线水平显著高于治疗失败者；钙卫蛋白基线水平高，则短期治疗有效的比值比越高；多变量回归分析显示基线高水平钙卫蛋白是药物疗效的独立影响因子；利用接收者操作特征分析(ROC)分别确定了TNFi和抗CD20临床疗效(EULAR优良+中等)的钙卫蛋白基线预测界值。

三、钙卫蛋白以及S100A9对生物制剂治疗RA的疗效预测作用

阿姆斯特丹大学医学院Paul P Tak教授所率团队在上述最大样本量研究(n=170)中初步证实MRP8/14对TNFi和抗CD20治疗RA的疗效预测作用，他们在2016年3月发表了一篇钙卫蛋白结合临床参数辅助实现个体化用药的概念原型研究(3)。该研究基于基线钙卫蛋白血清表达水平、临床及实验室指标构建了预测模型，为临床医生选择生物制剂（TNFi或抗CD20）提供参考。该研究所纳入研究对象仍是前述的170例RA患者。构建预测模型时纳入的基线参数有DAS28、钙卫蛋白、IgM-RF、HAQ、既往使用过TNFi等，最后得到疗效预测公式（图2）。逻辑回归分析显示, DAS28和钙卫蛋白基线水平越高，则预测达到EULAR优良+中等的可能性越高，而IgM-RF阳性、HAQ基线分值高以及既往用过TNFi则降低获得良好疗效的可能性。在获得每例患者的上述基线参数后，该预测模型得出每例患者使用TNFi或抗CD20或良好疗效的概率（例如>0.9是高概率，<0.5是低概率，介于这两者之间就是中等概率）。如果TNFi预测疗效为高概率，而抗CD20为中或低概率，则推荐选择TNFi，反之则推荐抗CD20；如果TNFi和抗CD20疗效概率相同，则不作任何推荐或在两药疗效概率均低时推荐其它作用机制的药物。应用预测模型所推荐药物而得到的良好疗效预期达标率，比实际观察所得达标率约高10%。

法国学者Antonie Obry等人利用一种基于质谱且无需标记的蛋白组学技术(图1)在RA患者血清中鉴定出了有可能用于预测依那西普联合MTX短期(6个月)临床疗效的一组蛋白，共7种，其中包括钙卫蛋白的组成之一S100A9(MRP14)(4)。研究者首先用一组22例RA患者作为训练组，其中12例为治疗有效(EULAR反应标准)，10例为治疗无效，从这两组患者血清中鉴定出12种差异表达蛋白(例如在治疗有效组高表达而无效组低表达)。然后，研究者在第二组患者中(7例治疗有效，9例治疗无效)用上述相同的蛋白组学技术重点验证上述发现的差异表达蛋白，结果有7种蛋白在第二组治疗有效和无效患者之间仍有相同的显著表达差异，包括CERU、CO7、ITIH1、PLMN、PROS、S100A9和ZA2G，其中前五个属于急性相蛋白。接收者操作特征曲线分析显示, S100A9作为单独的疗效预测因子的敏感性和特异性分别100%和87.5%。其它6种蛋白的曲线下面积(AUC)均大于0.80，它们中任何一个与S100A9组合的疗效预测特异性和敏感性均达到100%。在第一组患者血清中发现最具疗效鉴别力的是CO7和PROS，随后在第二患者血清中用相对定量分析得到了验证。用ELISA检测对这两种蛋白进行绝对定量后，研究者用ROC分析确定了它们判定疗效的血清浓度界值，特异性均为71.4%，两者联合的疗效判定敏感性和特异性分别为88.9%和100%。法国学者Antonie

Obry等人在2014年发表的一篇研究采用相同的蛋白组学技术以及两组小样本RA患者，已经发现S100A9是MTX初治失败的RA患者接受依那西普联合MTX 24周治疗的疗效预测因子(5)。

四、讨论

与RA传统生物标记CRP和ESR相比，钙卫蛋白的显著特点在于它是在关节炎的局部产生并释放，而CRP主要由肝脏产生，外周血钙卫蛋白水平上升更准确地反映出炎症关节中白细胞的活化。关于钙卫蛋白在炎性滑膜的具体起源，目前尚缺乏直接证据。所以，就活动性RA的标记物而言，钙卫蛋白的特异性还未完全明确，未来还要明确共患病是否也会导致钙卫蛋白外周血水平上升。

由于钙卫蛋白稳定性较好，无需冷藏标本，这将有利于未来多中心研究以及在临床实践的应用。上述系统性综述建议钙卫蛋白的检测方法需要完善和统一。复合生物标记疾病活动度评分(MBDA)目前在RA临床实践中已得到初步应用，MBDA检测包含12种蛋白。当初开发MBDA时，钙卫蛋白也是备选标记，但之后由于检测方法学的问题而遭舍弃。未来还要明确异嗜性抗体(例如类风湿因子)是否会干扰钙卫蛋白的检测。

荷兰学者的研究(n=170)显示生物制剂(TNFi和抗CD20)治疗4周时，治疗有效者外周血钙卫蛋白水平就与无效者之间有了显著差异，并且这一差异持续至16周，这提示外周血钙卫蛋白可能有助于监测生物制剂的早期疗效。

法国学者提到他们利用无标记蛋白组学技术发现的差异表达蛋白与既往高通量蛋白组研究没有明显的重叠，例如既往有研究发现单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)可能对依那西普治疗RA有疗效预测作用，法国学者解释称S100A9和MCP-1的共同生物学效能是促进炎性细胞的迁移，并建议未来将二者放在一起进行验证(5)。

综上所述，目前研究表明RA患者钙卫蛋白外周血水平有显著的个体差异，外周血水平与疾病活动性有关联，并随有效治疗而下降。在预测RA的放射学损伤以及药物疗效方面，钙卫蛋白可能有一些作用，尤其是联合其它生物标记(例如临床参数、常规实验室指标以及其它新型蛋白标记)的组合预测作用。但是，鉴于文献报道的方法学(试验设计以及实验室检测方法)的缺陷，目前的证据水平还不足以将钙卫蛋白推荐为常规检测。为了严格检验钙卫蛋白能否用作类风湿关节炎的生物标记，未来还需要良好设计的大样本研究，开发合适的统计学模型以控制或校正混淆因素，对实验室检测方法进行标准化等。

表1. 探究钙卫蛋白作为RA预后和疗效的预测因子的研究

NR:未报告; ROC分析:接收者操作特征曲线分析; RAAD:类风湿关节炎关节损伤评分;IFX:英利昔单抗; ADA:阿达木单抗; RTX:利妥昔; GC:糖皮质激素; SJC:肿胀关节计数; SAA:淀粉样蛋白A.

                                      

图1. 鉴定生物标记的流程示意图(4)。该流程图代表无标记定量蛋白组学技术的不同实验阶段。在获得样品之后，先用生化方法抽提蛋白，然后用SDS-PAGE进行电泳以初步分离蛋白。切割收获不同分子量的蛋白胶条，用胰酶对其进行消化降解，然用进行液相层析和质谱分析(LCMS)。相应的质谱检测结果转换为两维LCMS图谱(坐标轴分别为m/z(质合比)和滞留时间。可以对不同样本之间的独特肽段离子谱进行整合，根据已有蛋白质谱数据对样本中的肽段进行注释。最后，根据不同蛋白的代表性肽段在样本中的丰度，确定特定蛋白的相对表达水平。

图2. TNFi和RTX治疗RA的疗效预测公式

用RTX时Drugtype=0,用IFX时Drugtype=1; RF:类风湿因子; HAQBL:基线HAQ; BLM:基线钙卫蛋白; DASBL:基线DAS28

参考文献：

1.张力奋,夏成云. s100a8/a9在自身免疫性疾病中作用的研究进展.中华临床医师杂志（电子版）2015:3087–3090.

2. Abildtrup M, KingsleyGH, Scott DL. Calprotectin as a biomarker for rheumatoid arthritis: asystematic review.J Rheumatol2015;42:760–770.

3. Nair SC, Welsing PMJ,Choi IYK, Roth J, Holzinger D, Bijlsma JWJ, et al. A Personalized Approach toBiological Therapy Using Prediction of Clinical Response Based on MRP8/14 SerumComplex Levels in Rheumatoid Arthritis Patients.PloS One2016;11:e0152362.

4. Obry A, Hardouin J,Lequerré T, Jarnier F, Boyer O, Fardellone P, et al. Identification of 7Proteins in Sera of RA Patients with Potential to Predict ETA/MTX TreatmentResponse.Theranostics2015;5:1214–1224.

5. Obry A, Lequerré T,Hardouin J, Boyer O, Fardellone P, Philippe P, et al. Identification of S100A9as biomarker of responsiveness to the methotrexate/etanercept combination inrheumatoid arthritis using a proteomic approach.PloS One2014;9:e115800.

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