订书肽的合成方法

蛋白−蛋白相互作用 (PPIs) 在调节机体生命活动中起着决定性的作用, 是体内众多信号传导通路的 关键机制, 其中很多关键蛋白质是可以利用的潜在药物靶点。探索有效调控蛋白−蛋白相互作用的方法, 将对生 理学以及药物研究大有裨益。绝大多数蛋白−蛋白相互作用以相对较大且较浅的作用面模式进行, 小分子难以形 成有效结合或调控。将蛋白−蛋白相互作用中以多肽二级结构为支撑骨架的折叠亚结构域中的α-螺旋肽单独提取 出来, 通过化学合成的方法加以构建将有可能得到选择性作用于靶标蛋白的活性多肽药物先导物。然而大部分 多肽片段在离开蛋白质整体结构后将无法稳定形成结合所需的二级结构, 而易于形成无规则卷曲构象从而导致 结合活性下降, 并且更易受肽酶的降解, 无法直接成药。应用全碳骨架形成侧链环合结构改造多肽来稳定α-螺旋 肽的活性构象, 即订书肽 (stapled peptide), 成为克服这一缺陷的最直接最有效方法。该方法不仅可以提高其原 本的蛋白结合活性, 而且具有较高的代谢稳定性和细胞膜通透性。基于这些显著的优势, 订书肽已经成为一类重 要的活性多肽结构改造方式, 也必将由此形成更多的以蛋白−蛋白相互作用为靶点的新型多肽药物。本文将着重 综述并讨论通过化学手段合成订书肽的方法及其药理活性研究进展。

常见订书肽订合方式如下图：

常见订书肽键合方式

关键砌块：

合成订书肽的关键砌块一般是具有α-烯烃侧链的非天然氨基酸 (下图), 目 前的研究主要采用α-C的绝对构型为S或R的手性 烯基非天然氨基酸, 简称为Sn或Rn (n为侧链烯基中 碳的个数)。此外, 还有用于缝合肽改造的 α-双烯基 取代氨基酸, 如B5 。通过高效、低耗、简便的有机 合成方法制备上述的关键砌块是订书肽合成的必要 条件。国内外许多课题组以不同策略建立了不对称合 成手性氨基酸方法, 目前效果较好的方法包括: 以噁 嗪酮 (oxazinone) 为手性配体, 通过不对称烷基化反 应合成目标化合物; 通过手性配体BPB (benzyl prolylaminobenzophenone) 与金属镍、丙氨酸 (甘氨 酸) 反应生成复合底物, 经过手性诱导合成高对映选 择性的手性氨基酸。

关键“砌块”的构建

三唑桥环

点击化学 (click chemistry) 中的 Huisgen-1,3 偶 极环加成反应是在铜催化下, 炔基与叠氮基反应 生成区域选择性的1,4-取代三唑

硫代桥环

在多肽或者蛋白质的修饰改造中, 半胱氨酸的 衍生化已成为一种必不可少的构建方式, 也是化学 生物学研究的重要方法。虽然目前改造半胱氨酸的方 法有烷基化、共轭加成、氧化和还原等方法

硫代甲基联苯桥环

了利 用4,4'-二溴甲基联苯 (Bph) 或6,6'-二溴甲基-2,2'-联吡 啶 (Bpy) 作为连接臂, 通过与i, i+7位的半胱氨酸侧 链反应形成硫代甲基联苯或联吡啶桥环 ； Muppidi 等做的具有p53-MDM2/MDMX相 互作用双重抑制作用的多肽序列 (LTFEHYWAQLTS) 改造中。

硫代氟苯桥环

以全氟苯或 全氟联苯为连接结构, 立体专一性地串联起i, i+4位 的巯基侧链从而形成硫代氟苯桥环。应用此方法进行 了HIV-1病毒衣壳CAI蛋白片段的改构设计, 该方法 得到的订书肽能有效抑制HIV-1病毒的形成, 且在结 合能力、穿膜能力以及酶解稳定性上都优于未经过改 造的原形肽

硫代四嗪桥环

在对半胱氨酸残 基侧链改造时, 通过 3,6-二氯-1,2,4,5-四嗪与巯基发 生取代反应后形成硫代四嗪环来稳定 α-螺旋构象。

巯基−烯点击反应

了利用巯 基−烯点击反应构建订书肽以及多肽的大环化。以不 同长度的二烯与两个肽链巯基在365 nm光照下室温 反应, 在i, i+4 与 i, i+7 位点之间构建硫代桥环的同 时, 对其他官能团有极好的耐受性, 因此可以在氨基 酸侧链未经保护的状态下进行反应

巯基−炔点击反应

了运用光 引发的单组分巯基−炔点击反应, 高效简洁在侧链未 经保护的α-螺旋肽上构建硫−烯桥环。在肽链的i, i+4 位上分别引入戊炔甘氨酸 (M5) 与半胱氨酸, 随后 在365 nm的光引发条件下完成桥环的构建。用该策 略对调节雌激素受体−共同激活剂相互作用的α-螺旋肽进行改构, 通过与全碳氢链改构后的订书肽的比较, 显示硫−烯桥环订书肽亲脂性变化较大而且细胞 膜毒性较低。硫碳双键为进一步的功能化提供了可 能, 同时也丰富了订书肽的改构方法, 将古老的硫与 炔自由基加成反应扩展到了化学生物学的研究中来 。

炔烃复分解反应

将烯 烃复分解 (RCM) 与炔烃复分解 (RCAM) 反应以正 交的方式联合应用于多肽的结构改造中, 其关键环 节在于除了向目标肽中的四个环合位点 (i, i+3, i+4, i+7) 中的两处引入烯基氨基酸 (S5) 以外, 在另外两 个位点处需引入侧链为炔基的非天然氨基酸。由于 RCM 反应 (钌催化) 和 RCAM 反应 (钼催化) 条件 的正交性, 与双订书肽相比, 可以选择性的控制 环合的的位置从而实现对环肽拓扑结构的控制。作者 将该方法应用于GTPase酶抑制剂的环肽改造中并得 到了活性改善的抑制剂StRIP3 。

订书肽通过用侧链环合的方法提高了 α-螺旋肽 的构象稳定性从而极大的提高与靶蛋白的亲和力、代 谢稳定性、穿膜性。订书肽在药效、成本以及技术难 度上填补了小分子药物与单克隆抗体在蛋白−蛋白相 互作用为靶点的药物研究中各自的不足, 已成为获 得以蛋白−蛋白相互作用为靶点的药物先导物的一种 有效途径。

已经报道的活性订书肽有：

前面是原始肽 订书肽

βAla-ERLRRRIEL- CRRHHST βAla-ERLRRRI[S5LCRS5]HHST

LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRMLF LSQEQLEHRERSL[S5TLRS5]IQRBLF

EENPESILDEHVQRVMK RRWPR[S5ILDS5]HVRRVWR

ITFEDLLDYYGP ITF[S5DLLS5]YYGP

BTWBEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQ EKNEQELLEBTW[S5EWDS5]EINNYTSLIHSLIEESQNQ[S5EKNS5]QELLE

TAYFLLKLAGRW TAYF[S5LKLS5]GRW

PSGSNIISNLFKEDH PS[R8SNIISNS5]FKEDH

FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST FD[R8SISQVNS5]KINQSLAFI[R8KSDELLS5]NVNAGKST

VNWKKILGKIIKVVK V[S5WKKS5]LGKIIKVVK

GFLSILKKVLPKVMAHMK GF[R8SILKKVS5]PKVXAHXK

GILDTLKQFAKGVGKWLVKGAAQ TLKQF[S5KGVS5]KWLVK

VVGLALIVAGVVV V[R8GLALINS5]- GVVV

HKILHRLLQDS EKHKIL[S5RLLS5]DS

VLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ VLESFKVS[S5LSALS5]EYTKKLNTQ

VRKRTLRRLLQERELVE VRKR[R8LRRLLQS5]RELVE

本文参考中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京市活性物质发现与适药化研究重点实验室 李 博, 杨潇骁*, 李 莉 ，文章，图片来源DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1215

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