目录
众所周知，显微成像技术一直受限于阿贝衍射定律，约为光波长的一半。可见光中波长最短的光为紫光，约为400nm。由此可知，衍射极限大约被限制在200nm。
衍射极限的定义与艾里斑和瑞利判据有关。艾里斑：点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍射的影响，所成的象不是一个点而是明暗相间的圆形光斑。瑞利判据即为两个艾里斑的重叠程度。即当一个艾里斑的中心和另一个艾里斑的边缘暗环刚好重合时，认为两个像斑刚好能够分辨。
要想对更细微的世界进行探究，就需要在衍射极限上找突破口。目前常见的有两种方式，一是突破衍射极限，二是绕开衍射极限。
1.突破衍射极限的方法
突破衍射极限的主要从点扩散函数入手，点扩散函数PSF描述了成像系统对点源或对点对象响应，如果能够使光学系统的点扩散函数尽可能的接近或成为一个理想的点，则可以使光学系统突破衍射极限。首先可以通过物理手段减小点扩散函数，典型应用就是后文所介绍的受激发射损耗荧光显微成像技术（STED）,其原理是用普通的激发光使荧光物质发光的同时，用波长较长的高能量脉冲微光器产生一束环形的耗竭光将荧光物质猝灭，减小荧光点的发光面积，提高分辨率。其次，可以通过改变光学的点扩散函数大小，典型应用是结构照明显微成像技术（SIM）。原理是通过有结构的光学照明产生的莫列条纹来提高图像的分辨率。
1.1受激发射损耗荧光显微成像技术STED
STED显微技术是第一个突破光学衍射极限的远场显微成像技术，既然提到远场，那必然存在着近场显微成像技术。近场指的是物体表面小于一个波长（或λ/2）尺度范围内的区域，其核心问题是对于隐失波的探测。隐失波这个词看起来很陌生，其实就是衰逝波，是光波在两种介质产生全反射时的光学现象。衰逝波沿着界平面平行的方向回产生光波，其电场及磁场的复振幅随着远离临界面的距离的增大而呈现指数级的减小趋势。近场显微成像技术的典型应用为电子显微镜，已经达到了0.1nm的超高分辨率，但它无法适用于活细胞成像。在生物医学领域对活细胞成像是一项十分重要的研究，因此远场显微成像技术应运而生。远场显微成像技术不仅能够对活细胞成像，而且具有无损伤，设备简单，工作距离远等优点。
- STED技术的原理
STED系统原理图
STED基本原理是采用两束激光同时照射样品，其中一束激光用来激发荧光分子，使物镜焦点艾里斑范围内的荧光分子处于激发态；另一束光为损耗光，可以使物镜焦点艾里斑边沿区域处于激发态的荧光分子通过受激辐射损耗过程返回基态而不自发辐射荧光，因此只有中心区域的荧光分子可自发荧光辐射，从而获得超衍射极限的荧光发光点。简单来说，激发光的作用是将荧光分子激活，而损耗光（STED光）的作用是将荧光猝灭。这个原理实际可以用更形象的例子来描述，怎样用粗的笔画细的线？借助橡皮这个工具擦除就可以了。图中绿色代表激发光，红色代表损耗光。红色甜甜圈样式的环形损耗光2的作用就类似于橡皮擦，它抑制荧光分子发出光子，仅留下中央点发光被并观察。此时的就已经超越衍射极限的限制，获得更高的分辨率。
该技术的核心是荧光分子的受激辐射性质。有机荧光物质是一类具有特殊光学性能的化合物，它们能吸收特定频率的光，并发射的低频率（较长波长）的荧光来释放所吸收的能量。某些有机化合物在紫外和短波长的可见光的激发下能发出荧光，产生可见光谱中鲜艳的颜色。
如下图所示，激发光可以使基态荧光粒子从基态跃迁到激发态，随后用损耗光照射样品，引起荧光物质的受激辐射，消耗可以发射荧光的能级上的粒子数。受激辐射的作用是迫使粒子在它们被激发之后立刻回到基态，使焦斑上那些受到损耗的荧光分子被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的发光点。
有效荧光团能级图
目前报道的STED方法通过使用特殊的荧光材料，分辨率最高可达到6mm。STED方法是一种直接成像方法，无需后期处理过程，成像结果可靠。但想到获得较高的分辨率，就需要以牺牲成像速度和成像范围为代价，该技术的系统光路复杂、价格昂贵。
1.2结构光照明超分辨光学显微成像技术(SIM)
任何一个光学系统可以看作为一个低通滤波器，其可通过的空间频率带宽由光学传递函数决定，高于这一空间频率的信息都不可以通过，SIM技术通过空间频率混合的方式将样品中高空间频率的结构信息编码至低空间频率的图像来实现超过衍射极限的光学成像。
SIM的基本原理是莫列条纹。莫列条纹：由两个空间频率相近的周期性光栅图形叠加而成的光学条纹。当两条线或两个物体之间以恒定的角度和频率在发生干涉，而人眼无法分辨这两条线或两个物体时，只能看到干涉的花纹。
下图我们可以更加直观地了解莫尔条纹是如何用于显示高频信息的：当两个小尺寸（高频）网格叠加覆盖在最右边的图像中时，它们之间发生干涉后就会显示一个较大尺寸（低频）的网格，这个网格会包含两个较小网格的信息。
两个相互成一定角度重叠的细网格相互干涉形成的莫列条纹
在实际使用时，通过在照明光路中插入一个结构光的发生装置（如光栅，空间光调制器，或者数字微镜阵列DMD等），照明光受到调制后，形成亮度规律性变化的图案，然后经物镜投影在样品上，调制光所产生的荧光信号再被相机接收。通过移动和旋转照明图案使其覆盖样本的各个区域，并将拍摄的多幅图像用软件进行组合和重建，就可以得到该样品的超分辨率图像了。
- 结构光照明收集高频信息
对于所有的结构光照明超分辨技术，其收集高频信息的原理都是基于照明图像对物体频谱的调制作用。自然界中，物体的表面可以看作是一个图像信号。这个图像信号可以根据空间频率的不同，分解成多个频率分量。故自然界中常见的物体频谱形状一般都可以简化成一个三角形，如图所示。
物体频谱
分辨力带宽内描述的是物体能够被成像系统清晰成像的部分，带宽以外的则是在成像过程中所丢失的物体高频信息部分。在使用均匀光照明的情况下，对应的像频谱就会如图所示，带宽以外的频谱将会被去除，只保留带宽以内的频谱。
衍射像频谱
同时也把物体频谱分为以蓝色表示的低频信息和以红绿色表示的高频信息。如果物体频谱在频率轴上发生偏移，那么总会有高频信息将进入分辨力带宽内，若能收集这部分高频信息就有机会实现超分辨成像。使用条纹结构光照明时，条纹会对物体的结构信息进行调制，受调制的物体频谱形状会发生明显的变化。对正弦条纹结构光表达式作傅里叶变换可以将最终的结果分解为下图所示的三份频谱的叠加。
衍射像分解频谱
三份频谱中，处于中间的频谱是物体原始的频谱，两边的频谱则是因条纹结构光的调制作用额外复制的频谱。 向左偏移的频谱中，红色指代的高频信息成功进入到分辨力带宽内，同样地在向右偏移的频谱中，绿色指代的高频信息也同样进入分辨力带宽内。正是由于复制频谱与原物频谱的高度一致性，才使得高频信息可以被完整无缺地收集起来。
结构光超分辨的重构方法
结构光的调制作用对所有频谱都是适用的，在受调制物体成像频谱中，原像频谱、被复制的低频信息和被复制的高频信息之间会发生严重的混叠。这导致高频信息不能被直接分离，需要使用重构算法进行求解。传统的具有代表性的重构算法有两种，一种是基于相位正负关系的四步相移法（四步相移法的原理是基于正余弦函数的余角、补角的正负关系对高频信息进行求解的。该方法需要设计并产生四束相位差两两相差π/2的结构光，分别对物体调制），另一种是基于方程组思想的三步相移法（其原理是求解线性方程组，即可分离各待求变量）。传统相移方法在一个方向上至少需要采集3幅调制成像，在多方向超分辨成像中，相移次数增多会限制成像速度。无需相移的结构光超分辨重构方法，该方法只需要采集两张在不同照明光下的图像，一张是受条纹结构光照明的物体成像，另一张则是受普通均匀光照明的物体成像。该方法大大地放宽了硬件设备的技术指标要求，同时能够保持算法思路上的简单性和易操作性。
小结
结构光照明超分辨光学显微成像技术是尝试在频率空间中对系统做适度改造，让物体的频谱在频率轴上发生偏移，使得原本处于光学传递函数之外的高频部分得以进入光学传递函数，由后期算法分离出高频部分，并还原重组得到超分辨像的频谱。
2绕开衍射极限的方法
典型应用为单分子显微技术：通过确定单个荧光分子位置的精度的提高，可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级。尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率。不管是哪种超分辨率成像方法，其点扩散函数（PSF）成像仍然与传统显微成像一致。相对近场光学显微技术来说，是一种绕过衍射极限的超分辨方法
2.1随机光学重构显微术（STORM）
两个挨得很近的光点会让我们分辨不出谁是谁，那么如果我们分开来看呢？
也就是说，当我们照射并观察第一个点时，第二个点并不会发光，自然不会产生艾里斑影响我们观察第一个点，前者艾里斑的中心点位置就是荧光分子的准确位置。接下来，通过某种方法，让第二个点被照亮。这个时候第一个点又不在光斑的照明范围之内了，同样不会干扰对第二个点的观察。通过这种“以时间换空间”的设计，巧妙地绕开了阿贝极限（显微镜分辨极限）的束缚，将光学显微镜的分辨率大大提高。
STORM技术就运用了这种思想，它使用的是有机荧光分子对染料，并且通过一些方法使细胞内的一小部分荧光分子发光，而不是全部。这样由于发光的点分布比较分散，重叠比较少，因此每个光晕可以近似为一个荧光分子。在一次激发中，可以确定一部分光晕的中心，在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕的中心，把这许多次激发的结果叠加，就是完整而清晰的图像。
STROM成像过程包含一系列图像循环。每个循环中，只打开视野下一部分荧光基团，这样每个活跃的荧光集团都被分辨，它们的图像与其他分子分开，不重叠。这样确定了基团的准确位置，多次重复这个过程，每次随机打开荧光基团的不同亚基，得到图像，确定每个亚基的位置后，把以上图像重建成清晰的整个图像。理论上STORM可得到分辨率达到几个纳米的荧光图像。
它的基本原理与PALM类似，不同的是STORM使用合成的光转换荧光染料，而不是光激活荧光蛋白与目标分子结合。那么它是如何控制荧光的开关的呢？
荧光染料被激发进入发射态，之后会进入暗态（Dark state），在暗态中它们将与自由氧结合，进入漂白状态。在漂白状态下，染料不会再次发出荧光。如果不让染料与自由氧结合，它将无法进入漂白状态，一直维持在暗态。高功率的激发光可以使染料从暗态再次进入发射态。这种从亮到暗再到亮的状态切换看起来就像是染料在“闪烁”一样。
和PALM一样，STORM也是通过随机的分批“点亮”目标分子来进行超分辨定位（图5）。由于消除了光漂白步骤，STORM可以更快地采集数据。不过，STORM高度依赖于荧光染料的特性：既需要产生足够强的信号，同时又要有良好的闪烁密度。如果染料闪烁得太快，相邻的分子之间可能会有很多干扰，无法定位单个分子；但是如果它们闪烁得太慢，可能无法获得足够的图像来定位每个分子。STORM最初使用的染料是cy3和cy5，不过目前最流行的是Alexafluor 647。
STORM简易光路
STORM光路示意图
不同颜色激光通过反射镜与二向色镜进行合束，再将光耦合入单模光纤。利用凸透镜将光纤出射的发散光转变为准直光，再用另一个凸透镜把光斑聚焦于物镜后焦面，基本完成STORM光路的搭建。STORM一般基于全内反射显微术(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy,TIRFM)，利用TIRF物镜在基底表面产生一层极薄的(约100 nm)倏逝波，只激发紧贴在基底上的一层荧光探针，有效地减少了背景噪声，提高STORM成像的分辨率。STORM技术的实现离不开探测器装置的进步，数据采集需要强信噪比的空间成像器。
合束过程中使用到的二向色镜可以用三棱镜替代，调整各束激光相对棱镜的入射角度实现合束。此外，合束光耦合入光纤不是必须的，但优点是明显的：一是单模光纤本身具有滤波作用，保证出射光斑呈完美的高斯分布，便于后期耦合到显微镜光路；二是光纤可以把激光光路和成像光路分开，增强光路摆放的灵活性。当然，光纤同样存在缺点，光纤出射光的能量相比于入射光存在较大的损耗，要求激光器的出光功率需较大，增加搭建成本。如不使用光纤，可将合束后的激光通过物镜进行扩束准直，优点是光的能量损耗较小，缺点是物镜扩束光斑质量相对较差。
STORM成像过程需要对激发光和激活光强进行实时调制。比较高级的方法是在光纤耦合器前增加一个多通道声光可调谐滤波器(Acousto-optic Tunable Filter,AOTF)，可同时控制多束激光一级衍射光的强度。比较简单的方法是在每个激光器出光口设置带有衰减片的机械或电动转盘。
小结
这种超分辨显微技术都是通过选择性地打开和关闭单个荧光基团，确保成像区每次仅有少量、随机、离散的单个荧光分子发光，再通过高斯拟合，定位单个荧光分子(点扩散函数)的中心位置，以实现高精度的空间定位，最后将系列图片叠加合成一幅超分辨图像。
2.2 光激活定位显微技术（PALM）
PALM的原理其实非常简单，一句话概括就是通过“开关”与目标分子结合的光激活荧光蛋白，对其进行分批定位，确定中心光斑的位置。
光激活荧光蛋白PA-GFP是绿色荧光蛋白的变种，可以被适当波长（405nm）的激发光激活。实验时首先随机激活一部分荧光蛋白，再用488nm激发荧光，就可以只采集一部分目标分子的荧光信号。荧光蛋白被激活的概率与激发光的强度成正比，只要激活的蛋白足够少，相距足够远，就可以对其进行定位。完成数据采集后，对这些荧光蛋白进行光漂白直至完全失活，然后再激活另一些荧光蛋白进行定位。重复这个过程，就可以将样品中的所有目标分子定位，将这些原始数据合并，就能得到目标分子的超分辨图像。
下面举例以流程图更为直观的了解PALM的工作原理。
3.傅里叶叠层显微成像技术（FPM）
叠层成像技术中，其采集到的数据实际上是被测物体不同区域对应的探针波前与物体相互作用后的衍射图。随着计算机运算能力的提升，叠层成像技术在发展的过程中引入了迭代的概念。在图像采集时，使照明光斑与被测样品发生相对位移，且位移距离不能太大，需保证相邻的两个照明区域之间存在重叠区域。当我们按时间顺序把每一次照明都看作一个层时，则重叠照明之间的叠加便是所谓的“叠层”。
傅里叶叠层成像技术通过改变样本照明方向，采集相应低分辨率图像，并在频域中进行相位恢复和孔径合成，实现大视场、高空间分辨率和定量相位成像。
一个典型的傅里叶叠层成像系统由一个LED阵列和一个带有低NA物镜的常规显微镜所组成。低NA物镜的运用可以使系统以低空间分辨率为代价获得更大的成像视场。而LED阵列的运用可以使被测样品接受来自多个角度照明光的连续照射，在每个照明角度下，成像系统都会通过低NA物镜记录低分辨率的样本图像。
傅里叶叠层显微成像技术的显微成像系统主要由两大部分构成。其一是傅里叶叠层显微成像装置的衍射图像采集部分，其二是对采集到的衍射图像进行强度图像和相位图像重构部分。其原理可简述为：当照明光透过物体后发生衍射现象，出射光场会携带物体信息，波前将会发生改变。由于物体的高频信息衍射效果明显，发散角更大。因此，对于具有有限数值孔径的显微物镜，其只能够接收到衍射效应小，发散角更小的低频信息，部分高频信息则会丢失。当使用具有一定角度的倾斜光进行照明时，透过物体后的零级衍射光将会发生位移，使得更高频的信息可以进入透镜，从而被检测器记录成像。角度变换的照明光可等效为频谱中位置变换的光瞳函数，实验中利用采集到的低分辨率图像在频域中对相应位置的光瞳函数和对应区域内的频谱信息进行迭代更新，不同位置的光瞳函数交叠扩展频谱区域，扩大合成的数值孔径，从而能够恢复出待测物体的高频信息，得到大视场、高分辨率的结果。
其重构过程简述如下：
１）在空间域中假设一个物体的高分辨率初始值，其强度值一般选择为入射角为零时采集到的低分辨率图像，而物体的高分辨率相位信息一般初始为零。
２）在初始值的傅里叶域光谱中利用物镜的圆形光瞳函数选择一小区域的频谱信息，生成低分辨率目标复振幅分布。
３）保持目标复振幅分布中的相位信息不变，利用采集到的相应低分辨率强度图像对目标复振幅图像中的振幅信息进行更新。
４）对该更新后的低分辨率目标图像进行傅里叶变换，用求得的频谱替换初始值频谱内对应的区域。
５）对于不同角度的入射光，重复步骤（２）-（４），直到对所有频谱信息都完成一次更新。
６）当初始值的频谱信息都完成一次更新后即为一次迭代运算，一般需进行３－５次迭代运算即可获得物体的高分辨率复振幅信息。
1949
被折叠的 条评论
为什么被折叠?
到【灌水乐园】发言
