近期，一张图吸引了翘仔的目光，简明扼要的总结了不同肿瘤类器官培养方法的关键。
本文将详细描述图中类器官培养相关知识：
胃癌类器官培养简要步骤
结直肠癌类器官培养体系
肝癌类器官培养体系
乳腺癌类器官培养基组分 (Hans Clevers等)
肺癌类器官培养基组分及配制指南
卵巢癌类器官培养基组分优化方案
类器官的起源可追溯到1907年，但是经历了一个漫长的停滞期，直到近十年才得到快速发展，其中细胞因子的作用功不可没。2002年Michalopoulos等人发现在添加HGF和EGF的条件下，肝细胞可自发转化为胆道上皮细胞，解开了类器官发育的关键。2011年Spence等人在体外利用人多能干细胞成功培养出肠类器官，并发现Wnt3A和FGF4是肠类器官培养的必要因子，研究结果扩大了类器官的细胞来源并加速了类器官的发展。
自肠类器官培养成功以来，类器官技术在生物医学领域得到广泛发展，其巨大的优势受到肿瘤研究者的青睐。肿瘤类器官可通过诱导多能干细胞分化产生，也可直接从肿瘤组织中获得。非肿瘤类器官可在基因编辑后突变为肿瘤类器官，肿瘤组织多来自患者手术切除标本或穿刺活检组织。
肿瘤类器官培养主要步骤
接下来，我们将重点介绍几种重要的肿瘤类器官培养基组分及方案：
胃癌类器官培养：
通过构建源自胃癌患者的类器官（PDO），能够直接对临床样本进行研究。Vlachogiannis等人为了成功培养胃癌类器官，除了使用ADMEM/F12培养基和基底膜基质外，还添加了EGF、Noggin、R-Spondin 1、FGF-10等细胞因子。
胃癌类器官培养简要步骤
如下实验流程和数据均引用Vlachogiannis等人发表的文章（doi: 10.1126/science.aao2774），供参考。
配置类器官培养基：改良的DMEM/F12基础培养基，添加1x B27 additive、1x N2 additive、0.01% BSA、2 mM L-Glutamine、100 units/ml 青霉素-链霉素，以及如下表的细胞因子或其它添加物：
样本收集：通过图像引导或内窥镜手术收集活检样品。收获后，样本置于冷PBS中，并在冰上运输到实验室，20分钟-2小时内将组织切片切碎。
样本处理：组织切碎后，加入5ml 5mM的PBS/EDTA，室温静置15分钟。用含有2x TrypLe的1mM PBS/EDTA 5ml在37℃消化1小时。施加机械力（如吹液）以促进消化。
接种细胞：用改良的DMEM/F12培养基收集分离的细胞，并在4℃，1200转/分离心5分钟，使细胞成球状，用120µl GFR基质胶重悬，接种到24孔或48孔的平底细胞培养板中。
将基质在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养20分钟，进行固化。然后添加500µl 配置好的PDO培养基，要完全覆盖培养孔。
每两天换一次培养基。
结直肠癌类器官培养：
患者来源的肿瘤类器官已成为结直肠癌临床前研究的一种出色的模型，原代上皮细胞可在特定生长因子的控制下和3D细胞外基质（ECM）中成功培养类器官。肠上皮细胞的自我更新由位于隐窝中的Lgr5干细胞驱动。Wnt信号是维持隐窝干细胞活跃所必需的，Wnt激动剂R-Spondin 1是Lgr5的配体，诱导隐窝增生。EGF信号与肠道增殖有关，Noggin诱导隐窝数量的急剧增加。
结直肠癌类器官培养体系
如下实验流程和数据均引用van de Wetering等人发表的文章（doi:10.1016/j.cell.2015.03.053），供参考。
基础培养基：改良的DMEM/F12培养基，添加青霉素-链霉素、10 mM HEPES和Glutamax。
人肠干细胞培养基：Wnt条件培养基、R-Spondin 1条件培养基、Noggin条件培养基和基础培养基按照50%、20%、10%和20%的体积比混合，然后加入1x B27、1.25 mMn-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、50 ng/ml 人EGF、10 nM Gastrin、500nM A83-01、3 uM SB202190、10 nM Prostaglandine E2和100 mg/ml Primocin。
van de Wetering等人利用自己开发的培养基成功获得肠癌类器官，并通过H&E染色对原代肿瘤细胞和类器官进行分析，发现大多数类器官的特征是存在一个或多个管腔，与原代肿瘤的管状结构相似（如P8和P19b），没有管腔的的原代肿瘤会形成没有管腔的紧凑型类器官（P19a）。
肝癌类器官培养：
肿瘤类器官的培养非常复杂，如肝癌类器。原发性肝细胞癌主要分为肝细胞癌（HCC）、胆管细胞癌（CC）和混合型（CHC）。在肝细胞癌类器官培养中需要使用地塞米松，而不是常规的Noggin、R-spondin 1和Wnt3A。但是胆管细胞性肝细胞癌类器官培养则需加入R-spondin 1来维持细胞生长。
Broutier等人发现原发性肝癌（PLC）组织培养获得的类器官可以在体外忠实的模拟人类PLC的遗传复杂性。构建的类器官包含PLC常见的三种亚型：HCC、CC和CHC，再现相应亲本肿瘤的组织学结构和表达谱，并且所有亚型可长期培养或移植到小鼠体内。类器官还保留患者及亚型之间的差异性，有利于肝癌相关基因和潜在生物标志物的鉴定。
肝癌类器官培养体系
如下实验流程和数据均引用Broutier等人发表的文章（doi: 10.1038/nm.4438），供参考。
基础培养基：改良的DMEM/F12培养基，添加1%青霉素-链霉素、1% Glutamax、10 mM HEPES和1:50 B27添加剂。
经典人肝类器官分离培养基：Wnt条件培养基、R-Spondin 1条件培养基和基础培养基按照30%、10%和70%的体积比混合，然后加入1:100 N2添加剂、1.25 mM n-Acetyl
Cysteine、10 mM Nicotinamide、10nM 重组人Gastrin I、50 ng/ml 重组人EGF、100
ng/ml 重组人FGF10、25 ng/ml 重组人HGF、25 ng/ml Noggin、5 uM A83-01、10 uM
Forskolin、10 uM Y27632。肿瘤细胞特异性分离培养基：经典人肝类器官分离培养基中不加Noggin、R-Spondin 1和Wnt，添加3mM地塞米松。
肝癌类器官培养基：基础培养基、10% （体积比）R-Spondin 1条件培养基、1:100 N2添加剂、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10nM 重组人Gastrin I、50 ng/ml
重组人EGF、100 ng/ml 重组人FGF10、25 ng/ml 重组人HGF、5 uM A83-01、10 uM Forskolin。
乳腺癌类器官培养：
乳腺癌类器官的培养基与其它肿瘤的略有不同。Seino等人在类器官培养基优化过程中发现，Neuregulin 1与乳腺发育和肿瘤发生有关，将其添加到培养基中可维持类器官有效再生和长期增殖（超过20代）。Wnt-3A对类器官培养条件改善不明显。EGF对乳腺癌类器官培养具有双重作用，高于5 ng/ml促进细胞增殖，但会导致类器官解体，失去自组织功能，低浓度则相反。
乳腺癌类器官培养基组分
如下实验流程和数据均引用Hans Clevers等人发表的文章（ doi：10.1016/j.cell.2017.11.010 ），供参考。
| 培养基组分 | 浓度 |
|---|---|
| 改良型DMEM/F12培养基 | 1X |
| R-Spondin 1条件培养基 | 10% |
| Neuregulin 1 | 5 nM |
| FGF-7 | 5 ng/ml |
| FGF-10 | 20 ng/ml |
| EGF | 5 ng/mla |
| Noggin | 100 ng/ml |
| A83-01 | 500 nM |
| Y-27632 | 5 μM |
| SB202190 | 500 nMb |
| B27 supplement | 1X |
| Nicotinamide | 5 mM |
| GlutaMax 100x | 1X |
| Hepes | 10 mM |
| Penicillin/Streptomycin | 100 U/ml / 100 mg/ml |
a：类器官出现解体时减少或不添加
b：浓度超过1μM会降低类器官生成效率
肺癌类器官培养：
肺癌是全球常见的恶性实体肿瘤，但是肺癌早期临床表现不明显，容易与其他感染混淆而被忽视，一般确诊时已发展到中晚期，因此，及时准确的筛选合适的抗肿瘤药物对肺癌患者非常重要。人类癌症组织来源的类器官可以保持其亲代肿瘤的突变谱和组织学特征，缩短药物筛选时间。
Zhichao Li等人将从原发性肿瘤组织中衍生出肺腺癌类器官的操作指南提交到了STAR Protocols，成功率可达80%。
肺癌类器官的培养基
如下实验流程和数据均引用Zhichao Li等人发表的文章（10.1016/j.xpro.2020.100239 ），供参考。
主要细胞因子配制指南
如下实验流程和数据均引用Zhichao Li等人发表的文章（10.1016/j.xpro.2020.100239 ），供参考。
关键：所有操作都应在二级生物安全柜中进行，以保持无菌状态。
- 200 μg/mL FGF-10 (10,000X)
a. 取100μg溶于0.5mL无菌的PBS（加0.1% BSA，质量/体积）。
b. 每管5μL，将溶液分装到1.5mL的离心管中，可在-20℃保持3个月。
- 250 μg/mL FGF-7 (12,500X)
a. 取100μg溶于0.4mL无菌的PBS（加0.1% BSA，质量/体积）。
b. 每管4μL，将溶液分装到1.5mL的离心管中，可在-20℃保持3个月。
- 100 μg/mL R-spondin 1 (200X)
a. 取250μg溶于2.5mL无菌的PBS（加0.1% BSA，质量/体积）。
b. 每管250μL，将溶液分装到1.5mL的离心管中，可在-20℃保持1个月。
- 100 μg/mL Noggin (1,000X)
a. 取100μg溶于1mL无菌的PBS（加0.1% BSA，质量/体积）。
b. 每管50μL，将溶液分装到1.5mL的离心管中，可在-20℃保持2个月。
卵巢癌类器官培养：
目前，培养卵巢癌类器官的方法有多种，但成功率较高的是使用基质胶和改良DMEM/F12基础培养基的组合，并辅以EGF、FGF2、FGF10、Noggin、Rspondin1、p38抑制剂等，可使类器官培养成功率达到80%-90%。
Senkowski等人为了获得高级别浆液性卵巢癌（HGSC）类器官的长期培养方案，对培养基添加组分进行优化，获得两种成功率更高的配方。并且体外培养的HGSC类器官保留了原始肿瘤的基因组和表型特征，其药物反应与临床结果具有相关性。
培养基优化主要涉及添加物种类和浓度，尤其是细胞因子类。
研究人员在改良型DMEM/F12培养基中加入Glutamax、Primocin、N-acetyl-cysteine和B27添加剂构成基础培养基。
首先分析添加剂对HGSC原代细胞短期类器官形成和生长的影响。添加FGF-10、p38抑制剂SB202190或TGF-b受体抑制剂A83-01可改善类器官形成。
添加EGF、FGF-2或Noggin会导致细胞附着增加和类器官形成减少。
R-Spondin 1、Nicotinamide (1 mM) 或 prostaglandin E没有造成任何可观察到的影响。
因此，研究团队使用添加FGF-10、SB202190和A83-10的基础培养基（M 0.1）进行优化。
M
0.1培养基能促进生长，但在传代后并不能维持生长，需要探索并建立长期自我更新培养的因子。研究团队不仅测试研究报道中支持肿瘤类器官生长的因子，还对未被用于肿瘤类器官培养但属于HGSC干细胞重要信号的因子进行测试。结果显示：添加FGF-4会造成传代中类器官形成增加，在此之前未有FGF-4用于肿瘤类器官培养的报道。
单独或联合添加R-Spondin 1和Wnt条件培养基会导致HGSC类器官形成减少。 添加b-雌二醇能够增加HGSC类器官的形成和传代生长。
添加烟酰胺进一步改善类器官的形成，其效果与其浓度有关，最终确定HGSC类器官培养基配方中加入了5 mM 烟酰胺，形成培养基M1。
在培养基M1中添加EGF、Heregulin-β-1、Hydrocortisone和Forskolin，形成培养基M2。
对于不同的样品，M2可能具有促进或抑制类器官生长的“矛盾”结果，因此为了最大限度的提高类器官形成，每个HGSC样品应在两种不同的培养基M1和M2中平行培养。
义翘神州类器官培养手册：
总之，不同肿瘤类器官培养需要添加不同组合的细胞因子，以促进或抑制参与类器官形成的信号通路，获得所需的类器官。
义翘神州开发了一系列重组生长因子，具有高活性、低内毒素、高批间一致性和高纯度等特点，以实现类器官的最佳生长，并确保获得重复性好的实验结果。
义翘神州结合实际案例，整合资源，制定出全面的《3D类器官研究手册》，欢迎大家了解关注！
【参考文献】：
1 .Xianjie Jiang, et al. Organoids: opportunities and challenges of cancer therapy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2023, doi: 10.3389/fcell.2023.1232528
2 .Xin Ma,et al. Cancer organoids: A platform in basic and translational research. Genes & Diseases, 2024. https://doi.org/10.1016/j.gendis.2023.02.052
3.van de Wetering et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell, 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.053
4.Senkowski et al. A platform for efficient establishment and drugresponse profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell, 2023. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.04.012
5.Broutier, L, et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine, 2017. https://doi.org/10.1038/nm.4438
6.Calandrini & Drost, Normal and tumor-derived organoids as a drug screening platform for tumor-specific drug vulnerabilities. STAR Protocols, 2021. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.101079
7.Georgios Vlachogiannis, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science 359, 920-926 (2018)
8.Ji Wang, et al. Patient-Derived Tumor Organoids: New Progress and Opportunities to Facilitate Precision Cancer Immunotherapy. Front. Oncol. 12:872531. doi: 10.3389/fonc.2022.872531
9.Norman Sachs, et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.11.010
10.Ruoshi Shi, et al. Organoid Cultures as Preclinical Models of Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res 2020, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-1376
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