文献速递 | 张金方团队揭示免疫检查点PD-1调控新机制和肿瘤联合治疗新策略

文章信息

期刊：Nature Communications

影响因子（IF）：16.6（2023年）

标题：ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitination to modulate tumor immunotherapy

作者：张金方课题组

作者单位：武汉大学医学研究院

引用产品：

USP5 Protein, Human, Recombinant (His Tag)（货号：12772-H08B）（货号：12772-H08B）

产品应用：通过免疫印迹试验检测体外去泛素化结果

文章摘要

PD-1是T细胞上的一种抑制性受体，在促进癌症免疫逃逸方面具有重要作用。调节PD-1稳定性的泛素E3连接酶已有报道，但去泛素酶却仍未知。近期，武汉大学医学研究院的张金方研究团队发现泛素特异性蛋白酶-5（USP5）是PD-1的去泛素化酶。机制研究证实USP5与PD-1相互作用，导致PD-1的去泛素化和稳定化。细胞外信号调节激酶（ERK）会使PD-1在Thr234处磷酸化，促进PD-1与USP5的相互作用。有条件的敲除T细胞中的USP5会增加效应细胞因子的产生，并延缓小鼠肿瘤的生长。研究人员发现联合使用USP5抑制剂与MEK抑制剂或抗-CTLA-4抗体在多种小鼠肿瘤模型中具有更好的治疗效果。总之，该研究不仅揭示了免疫检查点PD-1调控的新机制，而且还提出了肿瘤治疗的新策略，具有潜在的临床转化意义。

研究背景

PD-1/PD-L1或CTLA-4的免疫检查点抑制剂已广泛用于治疗多种癌症。但随着临床治疗的深入，该疗法总体上仅对20-30%的患者有效。如何提高免疫检查点抑制剂的治疗效率，是目前肿瘤研究领域的热点和前沿问题之一。

PD-1（又称CD279）在活化的T细胞表达，与肿瘤细胞或其他免疫细胞上的配体结合，分别为PD-L1（又称CD274、B7-H1）和PD-L2（又称CD273、B7-DC）。PD-1与配体结合导致T细胞功能障碍和肿瘤免疫逃避。对PD-L1调控已有多层面的研究，但对PD-1，尤其是翻译后层面的研究较少。

泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰（PTM），在调节蛋白质稳定性和相互作用中发挥作用，维持各种细胞过程。泛素化和去泛素化过程是可逆的，受E3连接酶和去泛素化酶（DUBs）调控。研究发现FBXO38、KLHL22、c-Cbl等E3连接酶促进PD-1的泛素化和随后的降解，增强T细胞的抗肿瘤效应，然而调节PD-1的去泛素酶仍未有报道。

研究结果

01：去泛素化酶USP5是PD-1的正向调节因子

首先从4种去泛素化酶：USP5、USP10、USP15和OTUB1中，确定USP5是调节细胞中PD-1蛋白稳态的主要去泛素化酶。通过不同细胞系检测PD-1蛋白表达水平，敲低USP5可显著降低Jukat和MOLT-4细胞中的内源性PD-1蛋白水平。异位表达USP5并没有明显改变PD-1 mRNA水平，同样敲低USP5也没有引起PD-1 mRNA水平的变化，结果表明USP5主要在翻译后水平正向调节PD-1蛋白的稳定性。EOAI3402143已被确定为一种同时靶向USP5、USP9x和USP24的通用抑制剂。本研究发现EOAI3402143主要通过靶向去泛素化酶USP5降低PD-1蛋白丰度。

通过多重免疫组织化学染色检测人类直肠癌组织中的USP5和PD-1的蛋白表达，结果显示USP5与PD-1在人类结直肠癌样本中的肿瘤浸润CD3+ T细胞上共定位，表明T细胞中高表达的USP5可能稳定PD-1，从而抑制T细胞的细胞毒性功能，导致肿瘤发生。

02：USP5与PD-1相互作用并使PD-1去泛素化

免疫共沉淀实验证实USP5与PD-1结合亲和力强，在Jurkat、MOLT-4和小鼠原代CD3+ T细胞中检测到USP5与PD-1的内源性相互作用。USP5包含两个泛素结合相关结构域（UBA1和UBA2）。结果发现USP5通过UBA1和UBA2与PD-1相互作用。PD-1突变体证实其192至240位氨基酸残基区域可能是与USP5相互作用的关键。

体内泛素化试验表明异位表达USP5可特异性去除PD-1的泛素化，酶失活则不能去泛素化。来自杆状病毒-昆虫细胞表达的重组USP5蛋白可在体外直接去泛素化PD-1。表明USP5特异性地与PD1相互作用并去除细胞中PD-1的泛素化。

03：ERK使PD-1稳定并在Thr234处磷酸化 

磷酸化和泛素化是两种重要的翻译后修饰，它们之间的相互作用在调节蛋白质的命运和功能方面起着重要作用。研究团队发现ERK1、GSK3β、CDKs、AKT中，ERK1是最有效提高细胞中PD-1蛋白丰度的激酶。表达ERK上游刺激因子RAS或BRAF也能提高PD-1蛋白水平。IHC结果显示磷酸化ERK与结直肠癌样本中的PD-1共定位。此外，ERK1的异位表达显著延长PD-1蛋白的半衰期，表明ERK信号可能在翻译后水平上稳定PD-1。通过开发磷酸化抗体进一步验证ERK直接与PD-1相互作用并磷酸化PD-1的Thr234位点。本研究发现ERK、USP5和PD-1同时存在于内质网和高尔基体中，但N-连接糖基化和PD-1在T234位点的磷酸化可能互不影响，而是通过两条平行的途径调节PD-1在不同生理或病理条件下的稳定性和定位。

04：ERK介导的磷酸化可促进PD-1与USP5的相互作用 

Co-IP实验结果发现，异位表达ERK或其上游激活因子KRAS或BRAF可显著增强PD-1与USP5的相互作用。相反，抑制ERK活性可显著降低细胞中PD-1与USP5的相互作用。磷酸化缺陷型突变体与USP5的相互作用减弱。重组人USP5蛋白与ERK1磷酸化的GST-PD-1（192-288）在体外具有高亲和力。与PD-1野生型相比，磷酸化缺陷突变体被大量泛素化，对USP5介导的去泛素化具有抗性。抑制ERK的活化能够抑制USP5介导的PD-1的去泛素化。敲低ERK1/2抑制ERK的活性显著提高Jurkat细胞中内源性的PD-1泛素化水平。并发现ERK介导的PD-1的Thr234磷酸化促进PD-1与USP5相互作用，导致去泛素化和PD-1的稳定。

05：Usp5条件性基因敲除小鼠可有效控制肿瘤

与对照组相比，与USP5缺陷的细胞共培养的MC38细胞的凋亡明显增加，表明敲低USP5可以增强CD8+ T细胞对MC38肿瘤细胞的细胞毒性。与野生型小鼠相比，USP5缺陷不影响T细胞的发育和记忆T细胞群体。进一步研究发现T细胞中Usp5的缺失促进了CD8+ T细胞的活化，但可能不影响CD4+ T细胞和Treg细胞的功能。小鼠皮下肿瘤模型结果显示Usp5 cKO小鼠的MC38肿瘤生长速度更慢，存活时间更长。T细胞中的Usp5缺陷主要通过减少CD8+ T细胞中的PD-1表达来增强抗肿瘤免疫。

同时抑制USP5介导的PD-1在癌细胞和CD8+ T细胞中的表达进一步增强抗肿瘤免疫力。USP5抑制剂与Trametinib或CTLA-4阻断剂联合使用对抑制肿瘤生长具有协同作用。联合抑制USP5和ERK活化可能会对降低PD-1蛋白丰度产生叠加效应，更好地控制肿瘤生长在不同的临床前肿瘤模型中，联合靶向USP5和ERK信号对减少PD-1和抑制肿瘤生长具有叠加效应。

研究结论

本研究发现USP5是PD-1的特异性去泛素化酶，ERK会直接将PD-1胞质尾部的Thr234残基磷酸化，主要通过促进PD-1/USP5的相互作用来稳定PD-1，从而减少PD-1的泛素化和降解。在CD8+T细胞中敲除Usp5会降低PD-1蛋白表达，增加IFN-γ、TNF和granzyme B等细胞因子和细胞毒性分子的产生。与野生型小鼠相比，在T细胞中条件性敲除Usp5的小鼠能更好地控制肿瘤生长。USP5抑制剂与MEK抑制剂Trametinib或抗CTLA-4抗体联合使用，对抑制小鼠的肿瘤生长具有叠加效应。