【冷冻电镜|论文阅读】子断层平均 M 软件解读：Multi-particle cryo-EM refinement with M

题目&作者

Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells

Dimitry Tegunov（一作）（也是 Warp 的作者）。
本文发表在 Nature Methods，2021。

摘要：

• M software：建立了一个基于参考的多颗粒细化框架，集成了基于参考的颗粒运行轨迹细化和结构确定流程中的其他步骤。为 SPA 和 STA 提供了统一的优化框架（frame series and tilt series）。
• 实验表明了 STA 可以提供与纯化蛋白质样本的 SPA 获得相同的分辨率。表明了对齐步骤不再限制从断层扫描数据获得的分辨率。M 和 Warp、RELION 结合使用，将与完整细菌细胞内的抗生素结合的 70S 核糖体分解为残基水平（3.5埃）。

Results：

整体设计

● M 是 cryoEM 数据预处理和密度图细化流程的最后一部分，之前还有 Warp 和 RELION 或其他兼容的工具。

• Warp 对帧序列或倾斜序列进行初始的无参考运动矫正和CTF估计。对于倾斜序列，它调用了 IMOD 来进行倾斜序列对齐，使用倾斜角度作为约束来估计每个倾斜图像的 CTF 并重建层析体。然后使用 CNN 或模板匹配来挑选颗粒，并根据数据类型导出为剂量加权图像或体积。
• 颗粒的姿态和类别在 RELION 中确定。
• 将所有类导入到 M 中，进行更精确的、基于参考的、多颗粒帧或倾斜序列的细化，得到最终的高分辨率密度图。
• 以上步骤可迭代进行优化。

● M 提供了GUI 界面。项目被组织成种群，包括数据源和物种。

多颗粒系统建模：

M 将整个视野看成物理连接的多颗粒系统。
粒子可以属于不同的种类，它们可以具有不同的大小、对称性和分辨率。 粒子受到相同的全局变换，包括载物台的平移和旋转，以及由 BIM 引起的局部相关变换。 M 对这些变换执行基于参考的配准（图 2b），并在反向投影单个粒子图像时反转它们以获得更准确的重建。

在帧序列中，所有变换都发生在同一个图像参考帧中。 它们的组合效果被参数化为 3D 三次样条网格的金字塔（扩展数据图 1），以将快速的全局载物台运动与缓慢的局部 BIM 相结合。 该模型类似于 Warp 的无参考对齐，但由于高分辨率参考信号的增加，它适合更多参数。 除了图像空间扭曲之外，M 还可以拟合类似圆顶的运动（图 2b），作为散焦和方向偏移的参数网格实现。

对于倾斜序列，M 区分图像空间和体积空间的影响。 此外，可以为每个倾斜电影拟合一个粗略模型，以解释每次曝光中捕获的实质性变形。 体积-空间变换在 3D 中解析为累积曝光的函数。 因为 M 不会在中间步骤中平均粒子帧或倾斜，所以可以拟合每个粒子的平移和旋转轨迹。 可以根据粒子的大小以及每个粒子可用的信号为每个物种设置轨迹的时间分辨率。

图2：多粒子系统建模与优化。

a. 以往的算法将粒子视为孤立的实体，使用单独的代价函数(top)对其位姿进行优化。在M的多粒子细化框架中，视场内的所有粒子都被视为同一物理体积的一部分。利用单个代价函数(下)，同时优化它们的位姿和描述电子束引起的体积变形的超参数。

b. 多粒子系统变形模型包含几种模式:
全局运动和旋转，以解释帧间阶段运动和倾斜之间阶段旋转的不准确性;
图像空间扭曲，以模拟帧或倾斜图像的 2D 参考帧中的局部非线性变形；
体积-空间扭曲，以模拟重叠粒子垂直于投影轴的运动(仅倾斜序列)，和圆顶来解释薄样本沿投影轴的假设弯曲(仅帧序列)。

电子光学像差校正

除了几何变形模型，M 还拟合 CTF 参数和高阶像差，包括电子束倾斜。
● 对于帧系列，散焦针对每个粒子进行了优化，类似于 cisTEM 和最近的 RELION 版本。
● 对于倾斜系列，每次倾斜都会优化散焦，类似于 emClarity 中提供的功能。
对于这两种数据类型，每个系列都拟合散光、各向异性像素大小和高阶像差。

如果选择的粒子盒尺寸太小而无法保留高分辨率 Thon 环，则高散焦时的 CTF 校正可能会引入伪影，从而导致它们的混叠（扩展数据图 3a）。 M 自动选择足够大的框大小，在该框大小处数据由无混叠 CTF 预乘。 然后在真实空间中裁剪图像。 为了匹配这些图像的底层 CTF，正确的带限 CTF2 图像以类似的方式构建（扩展数据图 3a），用于细化和重建。

优化步骤

M 通过使用有限内存 Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (L-BFGS) 算法应用梯度下降优化，同时优化描述几何变形、电子光学像差和粒子姿态轨迹的所有超参数。目标函数是包含在视野中的所有提取的粒子图像之间的归一化互相关 (NCC) 的总和，以及由粒子的姿势和变形超参数定义的角度和偏移的参考投影（图 2a）。

在优化迭代结束时，类似于傅立叶环相关方法，M 计算参考投影和图像数据之间的每傅立叶分量 NCC。这用于优化与曝光和倾斜相关的数据加权，并使用更新的模型重建半图，校正 Ewald 球体曲率。因为 NCC 在 2D 中被解析，所以可以拟合各向异性权重以更好地利用第一帧，这些帧通常受到强烈的单向运动的影响。

密度图去噪和局部分辨率

M 没有使用传统的傅里叶壳相关 (FSC) 方法进行局部分辨率估计，而是使用物种的半图来训练基于 CNN 的降噪器，将它们过滤到局部分辨率以进行下一次细化迭代。 降噪器通过对从原始帧或倾斜中提取的图像进行反向投影，将noise2noise 训练方案应用于M 中每次迭代结束时获得的独立细化半图。 因为每个半图都是独立去噪的，所以在随后的细化迭代中不会引入和放大常见的伪影。

不同模块参数对于密度图分辨率的贡献

单个多粒子系统模型组件对分辨率的贡献。 通过扩展可优化参数组集获得的帧序列和倾斜序列脱铁铁蛋白数据的半图之间的 FSC。 从“无细化”基线开始，按照图例中自上而下的顺序，添加了一组新参数，同时保留先前添加的组，并从头开始进行细化。 图例中给出了每个步骤的分辨率。

我们得出的结论是，准确记录图像空间变形对于从帧和倾斜系列数据中获得高分辨率地图至关重要，而对其他效果建模会导致较小的改进，这些改进可能仅在低于 5 埃的分辨率范围内变得重要。 倾斜序列的初始无参考对齐不如帧序列准确。 然而，它允许获得可以在 M 中进一步细化的初始参考图和粒子姿势。给定相似数量的粒子，M 从帧或倾斜序列数据中获得相同的分辨率和非常相似的地图特征（图 5）。 因此，将数据收集为倾斜序列不会导致分辨率损失。 然而，由于倾斜序列的获取速度较慢并且通常用于拥挤、厚实的样本，我们预计从倾斜序列导出的 map 平均保持较低的分辨率。

和 RELION 在原子分辨率 帧序列数据 上的对比

和其他工具在倾斜序列数据微调上的对比

EMAN, emClarity

真实数据实验

M 能够可视化与细胞中 3.5 Å 的 70S 核糖体结合的抗生素。

讨论 & 结论

本文结果表明，将冷冻电镜框架和倾斜系列视为多粒子系统而不是孤立粒子集，并将其基于参考的细化与粒子对齐和 CTF 细化相结合可以提高分辨率。 新框架消除了以前倾斜系列数据处理的技术限制，在提供相似数量和质量的数据的情况下，可以实现与最先进的 SPA 结果相当的分辨率。
因为 3D 参考和子断层图像之间的相关性被证明等于参考投影与重建子断层图像的图像系列之间的相关性的加权和，所以我们能够在 M 中为帧和倾斜序列制定相同的细化过程。处理图像系列而不是重建的子断层图像可以降低计算复杂度并实现倾斜角和偏移的灵活细化。

尽管 M 的细化受限于多粒子假设，但其正向模型和重建算法以及 RELION 的 3D 分类都假设孤立粒子。 虽然这对于体外数据来说很少是一个问题，但对拥挤的细胞内数据的改进也将受益于扩展这些算法。 在 M 的灵活优化框架内，未来关于重建和分类算法的工作可能会通过明确地对多粒子系统进行建模以实现更高的分辨率来解决这个缺点。

总之，M 可以与Warp 和 RELION 组合成一个强大的低温 EM 数据处理流程，其中包括一个全面且可转移的 cryoET 工作流程。 该工作流程避免了不同软件包之间的文件格式和约定转换，使非专业用户能够获得最先进的结果。 它有可能实现细胞内粒子的残基水平分辨率图，并在其原生环境中捕获正在运行的大分子机器。 与互补的方法一起，它进一步为细胞中高分辨率结构生物学的新兴领域奠定了基础。

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$$Author:Chier$$