The design of reversible hydrogels to capture extracellular matrix dynamics是发布于《Nature Reviews Materials》上的一篇文章，主要介绍了将可逆化学物质引入水凝胶以捕获细胞外基质动力学的相关研究。传统水凝胶无法重现ECM的动态性质，而可逆水凝胶通过调节细胞扩散、生化配体呈现和基质力学等，能更好地模拟ECM。文章详细阐述了可逆水凝胶在可交换配体呈现、3D水凝胶可逆交联以及基质力学周期性变化等方面的策略和应用，并对该领域的未来发展进行了展望，包括实验控制、时间尺度考虑以及高通量方法的应用等。
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一、引言
细胞外基质（ECM）是一个动态环境，为嵌入的细胞提供物理和化学线索。传统水凝胶难以重现ECM的动态性质，为了更好地理解细胞与ECM的动态相互作用，设计更合适的体外模型和支架来指导细胞命运，许多可逆化学物质被引入水凝胶中。
二、水凝胶作为基质模拟物
2.1 组成
水凝胶的形成：水凝胶是由聚合物大分子或自组装成更大结构的小分子形成的水胀网络，通过共价、非共价或物理交联结合在一起。
应用实例：如聚（羟乙基甲基丙烯酸酯）、聚（丙烯酰胺）和聚（乙二醇）（PEG）等聚合物常用于合成水凝胶，这些水凝胶在隐形眼镜和药物递送等应用中早有使用。
与天然ECM的差异：传统合成水凝胶通常是无定形、均质材料，而非纤维状网络，且由于使用非天然聚合物，生物活性有限，细胞粘附通常通过整合素结合肽引入，如RGD或层粘连蛋白衍生的IKVAV，其结合效率和特异性与全长基质蛋白相比大大简化。
2.2 响应性水凝胶
刺激响应性聚合物网络的历史：材料科学界在设计响应各种刺激（如pH、温度、电场、磁场和光等）的聚合物网络方面有着丰富的历史，许多“智能”材料已整合了对特定生物目标的响应部分，特别是在药物递送应用中。
在3D细胞培养中的应用策略：包括被动水解降解或细胞介导的酶降解聚合物网络以允许封装细胞的扩散、增殖和基质沉积，以及光基反应使基质力学在粘附细胞存在时发生变化等。
局限性及可逆化学物质的优势：许多降解机制是不可逆的，会导致水凝胶随时间推移而侵蚀，无法捕获ECM重塑的周期性变化，且自由可溶性裂解产物对细胞行为的影响尚不清楚。可逆化学物质可解决这些局限性，实现生化信号的时空控制添加和去除，以及基质力学的重复变化。
三、用可逆水凝胶捕获基质动力学
3.1 可交换配体呈现
3.1.1 动态配体呈现的挑战：
天然ECM是多孔基质，能调节可溶性生化信号的扩散，许多可溶性信号被隔离并结合到基质中，其时空呈现与体内许多过程固有相关，从ECM释放通常由细胞通过蛋白水解或机械力介导。在体外重现这种动态呈现存在挑战，如将蛋白多糖或肽纳入水凝胶以呈现对生长因子的亲和力和动态关联可能导致多种相互作用，因此需要选择生物正交化学来精确控制配体的呈现和释放。
3.1.2 光基策略：
光基化学的吸引力：光基化学对于将配体共轭到水凝胶很有吸引力，因为许多光基反应可在生理相关条件下在细胞存在下快速进行，且光图案化可精确控制空间组织。
小分子光基策略：可逆光基策略主要集中于将小分子（如肽或染料）纳入凝胶。例如，在一项研究中，将罗丹明B和荧光素通过点击化学共轭到水凝胶中，由于它们含有不同的光敏官能团，可通过不同波长的光选择性地切割，从而实现配体的释放。
大分子光基策略：共轭大分子（如蛋白质）存在挑战，因为蛋白质在某些条件下可能变性或失去活性，且扩散时间较长。一些方法通过在蛋白质溶胀前将生物正交化学纳入水凝胶基质，实现高度特异性的点击反应，如一项研究结合了光笼和光降解化学，用于可逆地图案化玻连蛋白以调节封装间充质干细胞的成骨作用。
光基策略的局限性：一些蛋白质或生化配体在光图案化后可能稳定性和活性降低，且光毒性需要注意，许多光可裂解部分对紫外光响应，高强度紫外光可能损伤DNA，因此使用在较长波长具有高摩尔吸收率的化学物质更有利，可使用较低光强度和低能量光，减少对细胞的负面影响。
3.1.3 非共价策略：
分子识别实现动态配体呈现：分子识别（如蛋白质结构域、适体、寡核苷酸）提供了实现动态配体呈现的多种途径，具有高度特异性。例如，含有亮氨酸拉链结构域的RGD含肽被结合到表面以呈现细胞粘附结构域，通过引入具有互补亮氨酸拉链的PEG链可可逆地关闭肽的生物活性，随后通过可溶性竞争肽可去除PEG链，使RGD肽保持结合在表面。
非共价策略的优势：非共价策略允许细胞介导的基质变化来聚集配体，即使基质是共价结合的，生物活性配体仍可与细胞受体动态结合。例如，通过宿主 - 客体化学，配体作为客体分子与共价结合到基质的宿主相互作用，或通过将移动宿主分子穿在线性客体聚合物链上，可实现细胞粘附和基质信号的调控。
非共价策略的挑战：这些策略大多仅用短RGD肽进行了演示，将其扩展到全长蛋白质将有助于更直接地检查细胞信号事件，但这可能需要使用非天然化学部分对蛋白质进行位点特异性修饰。
3.2 3D水凝胶的可逆交联
3.2.1 共价水凝胶：
细胞在共价水凝胶中的扩散问题：当细胞被封装在静态共价结合的基质中时，无法扩散，导致形态改变，影响功能和命运。
与天然材料的差异：与天然材料（如胶原蛋白凝胶）不同，合成水凝胶大多由稳定的生物惰性聚合物制成，缺乏生物活性基序和纤维结构，难以实现细胞介导的局部重塑和扩散。
共价键对水凝胶性质的影响：共价键限制了水凝胶中柔性聚合物链的移动性，使其具有弹性，而天然ECM中的纤维通常含有动态物理连接，允许细胞重塑。
共价水凝胶的力学性质：共价水凝胶的剪切模量通常与频率和应变无关，但动态交联策略可为水凝胶基质的粘弹性性质进行微调，且对细胞行为有重要影响，如肌动蛋白细胞骨架和焦点粘附形成对周围基质的弹性和粘性性质敏感。
3.2.2 共价适应性凝胶：
共价适应性网络的原理：共价适应性网络使共价键可逆地断裂和重新形成，其断裂和重新形成的倾向由动态平衡常数（K）决定，K影响弹性活性交联的持久性，从而影响细胞的形态和运动。
在细胞负载水凝胶中的应用：将共价适应性键纳入细胞负载水凝胶相对较新，已有的研究表明这些水凝胶具有细胞相容性并能维持细胞功能。例如，在一项研究中，功能化RGD的腙凝胶中，封装的C2C12成肌细胞在24小时至10天内可延伸过程，这取决于键断裂和形成的动力学。另一项研究中，与单独的胶原蛋白凝胶相比，与胶原蛋白混合的腙凝胶形成的心脏组织更稳健，收缩力更大，这可能是由于胶原蛋白的信号和可逆共价键在组织沉积过程中维持稳健凝胶的综合作用。
3.2.3 非共价关联网络：
非共价关联网络的组成：非共价关联网络指通过钙配位、宿主-客体相互作用、氢键或物理相互作用（如蛋白质中发现的那些）结合的基质。
在细胞培养中的优势：具有剪切稀化行为，使其成为注射细胞递送载体的有吸引力的平台。例如，钙交联的海藻酸盐水凝胶不仅允许细胞重塑其环境，而且由于其动态离子交联，可实现比传统系统（如胶原蛋白或Matrigel）更大范围的模量。在一项研究中，不同模量的藻酸盐凝胶中人间充质干细胞的分化不同，中等刚度的凝胶为细胞提供了适当的阻力，使其能够施加牵引力并重塑周围环境，通过聚集RGD配体进行整合素结合和分化。
与生物材料的结合：通过利用生物识别的物理相互作用，可以控制K，一些基于蛋白质的水凝胶与脑组织弹性相当，进一步工程化可使其适用于更广泛的应用。
3.3 基质力学的周期性变化
3.3.1 动态模量的考虑因素：
ECM通过机械转导为细胞提供物理线索，影响细胞行为，基质的动态机械性质在发育和疾病中尤为重要。改变水凝胶力学传统上需要将细胞从一个底物重新铺板到另一个底物或改变体内胶原蛋白交联，这会对细胞行为产生混杂影响，而设计具有原位力学变化的水凝胶取得了很大进展，如通过在水凝胶交联剂中设计反应位点实现基质硬化和软化，但这些第一代化学物质是单向的且不可避免地改变了凝胶的化学组成，最近的方法包括使用机械可逆底物来研究与干细胞分化、纤维化和癌症相关的力学周期性变化。
3.3.2 控制基质力学的方法：
利用生物分子构象变化：许多生物分子（如DNA和蛋白质）在结合或杂交事件时会发生构象变化，当它们作为交联剂纳入水凝胶时，会导致交联密度变化，从而改变水凝胶的溶胀和模量。例如，DNA的杂交会导致长度和持久性长度的变化，一项研究中，通过引入互补的DNA链与聚（丙烯酰胺）凝胶的DNA交联剂杂交，可导致凝胶的硬化或软化，对应于模量的三倍变化。蛋白质也会在结合或暴露于环境刺激时发生可逆的构象变化，如钙调蛋白在结合吩噻嗪或三氟拉嗪时会发生约4nm的变化，腺嘌呤激酶在结合ATP时会塌陷约1.7nm，这些变化会导致水凝胶体积或溶胀的变化。此外，环境氧化状态的变化可改变蛋白质构象，从而赋予水凝胶可调的机械性能。
利用合成分子的变化：使用完全合成分子或现成的聚合物作为交联剂可提供更具成本效益的解决方案，并避免生物分子对细胞行为的混杂影响。例如，偶氮苯是一种可逆的合成光开关，可通过正交的、细胞相容的波长的光来改变水凝胶的模量，或在宿主-客体复合物中可逆地关联以调节水凝胶中的交联数量。胶原蛋白和藻酸盐聚合物可用于创建双组分水凝胶，其中胶原蛋白提供结构支持，藻酸盐可逆地凝胶化，通过引入钙离子使藻酸盐交联可使凝胶硬化，去除钙离子可使凝胶软化。
四、展望
实验控制和原位表征：可逆水凝胶的动态复杂性不断增加，原位表征方法对于实时监测细胞行为和基质变化非常重要。例如，生物学家开发的各种荧光探针和报告系统可用于监测细胞内蛋白质产生和细胞骨架组织，微颗粒跟踪流变学可用于测量细胞质力学，牵引力显微镜可用于可视化活细胞的牵引力应力，此外，荧光标记和微流变技术、基于荧光共振能量转移的力传感器以及磁共振弹性成像等技术可用于测量基质的局部力学性质。
时间尺度的考虑：细胞行为的时间尺度从秒到周不等，未来的研究需要选择合适的可逆化学物质来影响细胞的功能。可以考虑结合多种化学物质，一种具有短时间尺度以允许局部细胞扩散和运动，另一种具有长时间尺度以允许生长因子的信号传递几天。
高通量方法和智能支架设计：高通量组合方法和高含量成像技术可用于快速研究多种动态和时间实验条件，同时处理大量数据和进行多元统计分析对于提取重要结果和识别多个线索之间的协同效应至关重要。从增材制造或3D打印技术中汲取灵感，可创建能够为细胞提供动态线索的分层复杂结构，用于先进的组织工程应用。
五、结论
可逆水凝胶为模拟天然ECM的关键方面和引入时空精确信号以塑造细胞表型提供了有价值的平台，在组织工程和再生医学领域具有巨大的潜力。未来的研究需要进一步解决相关的挑战，以充分实现可逆水凝胶的潜力。
参考文献：
Rosales AM, Anseth KS. The design of reversible hydrogels to capture extracellular matrix dynamics. Nat Rev Mater. 2016;1:15012.
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