Cell：整合效率超 60%，中国科学院李伟/周琪等破解数十年难题，实现全 RNA 介导的基因精准写入...-CSDN博客

基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑工具素有「生命魔剪」之称，掀起了生命科学领域一场又一场波澜壮阔的革命。靶向基因整合对基因治疗和基础研究是至关重要的。数年以来，实现由双链断裂触发的大型转基因的高保真靶向整合存在着不容忽视的难度。即使是基于微同源介导末端连接（MMEJ）的方法，在哺乳动物细胞中介导大的外源 DNA 的靶向整合，依然效率低下。

为攻克上述难题，北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所李伟研究员与周琪院士团队开展了一系列承上启下的工作，2022 年 8 月 25 日在 Science 杂志发表研究论文 A sustainable mouse karyotype created by programmed chromosome fusion，成功地探索出在哺乳动物中大规模改造内源性或外来 DNA 的潜在途径，开发染色体编辑新技术，在全球范围内首次获得全新核型小鼠。

时隔不到一年，2023 年 7 月 4 日，合作团队在 Cell Discovery 杂志发表研究论文 High-efficiency targeted transgene integration via primed micro-homologues，该研究开发了用于高效转基因整合的强大基因编辑工具（PAINT 3.0 基因编辑工具），能够大规模操纵 DNA，通过插入 2.5kb 转基因在几个治疗相关的基因组基因座上，革命性地实现了高达 85% 的 KI 频率，在临床应用领域潜力巨大！

时隔一年零 4 天，2024 年 7 月 8 日，北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所李伟研究员与周琪院士团队联合在 Cell 杂志发表研究。首次突破了以 RNA 作为供体，助力功能基因尺度的大片段 DNA 基因组精准定点整合的难题，解析了自然界中 R2 逆转座子元件的生物多样性，利用供体 RNA 与 R2Tg 蛋白工程化改造，实现在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，最高效率超过 60%（以小鼠受精卵为例）。该研究聚焦 RNA 供体具有更低的免疫原性、可被非病毒载体有效递送、在细胞内迅速降解，无随机整合风险等特点，创新性地为基于靶向 DNA 整合的临床应用提供了工程化 R2 工具，并为进一步优化逆转录转座子系统提供了启示，为通过外源功能基因的精准写入来干预多种不同位点基因突变导致的单基因遗传缺陷等疾病，从而开发更为通用的基因与细胞疗法，搭建了广泛的应用前景！

来源：Cell

1. 系统分析和筛选天然存在的 R2 逆转座子

以往的研究显示，DNA 供体面临免疫原性高、在体递送困难、在基因组中具有随机整合风险等诸多挑战，因此利用 RNA 供体实现高效的位点特异性整合具有重要的价值。那么，如何找到合适的 RNA 供体呢？研究团队通过系统进化分析 R2 逆转录转座子的多样性，发现 R2 逆转座子具有与天然宿主基因组中 28S rDNA 位点特异性整合的独特特性，识别了在人类细胞中具有逆转录转位活性的 R2 系统。同时，发现 R2 逆转录因子内含子和 RNA 供体在两种不同的载体中表达，成功筛选出在哺乳动物细胞中具有完整 GFP 基因整合活性的 R2Tg 系统。

2. 供体 RNA 和蛋白质进行工程化处理可增强 R2 介导的基因插入活性

那么，影响 R2 整合活性的因素是什么呢？研究团队聚焦于 R2Tg 系统的供体 RNA 与 R2Tg 蛋白，进行了工程化改造。研究团队绘制了 R2Tg 供体 RNA 中的 UTR 元件的二级结构，发现 5'UTR 中含有 HDV 样核酶，删除 3'UTR 中的部分茎环结构能够显著提升 R2 在哺乳动物细胞中的逆转座效率。即 R2 UTR 区在其逆转录转位活性中起着重要作用。通过预测 R2Tg 蛋白三维结构和进化信息，对关键氨基酸定点突变 (Q955R,Q1062R, G1098R, and P1105R), 改造与核酸结合或加工相关的小蛋白结构域等方式，成功提高了 R2 系统的活性，最终获得了在人细胞系中超过 20% 基因整合效率的 en-R2Tg 工具。简而言之，R2 蛋白可以从多个角度进行工程设计，以提高其基因整合活性。

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3. 全 RNA 供体 en-R2Tg 可在哺乳动物细胞中实现有效的转基因整合

之后，研究团队聚焦于全 RNA 介导的精准大片段基因写入，通过体外合成获得了编码 R2 蛋白质 mRNA 以及供体 RNA，并使用脂质体递送的方式将两条 mRNA 导入人的细胞中。结果显示，即便在供体 RNA 的 R2 3'UTR 和 CMV 启动子之间插入了 200-2000bp 序列，工程化改造的 en-R2Tg 依然可以保持高效的基因整合（>10%），序列长度约为 2.5 kb。即 en-R2Tg 工具能够高效整合多个与疾病治疗相关基因，且这些基因能够有效表达功能蛋白。尤其在 HEK293T、Huh7 和 N2a 细胞中分别显示出 15.6%、24.8% 和 12.8% 的整合效率，能够以全 RNA 的形式发挥功能，意味着 en-R2Tg 工具可以高效使用。辅以脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，或将解决长久以来基因写入工具依赖病毒载体进行高效递送的难题！

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4. 优化的 en-R2Tg 系统在基因组中具有高度的靶向整合特异性

那么，工程化改造的 en-R2Tg 工具是否还具有位点特异性整合的能力呢？最后，研究团队利用高通量测序、功能实验等方法，证实了 en-R2Tg 工具在全基因组范围内展现了极高的基因整合特异性，超过 99% 的外源基因都精准整合，且 en-R2Tg 工具对细胞的转录组状态几乎没有影响。验证了 en-R2Tg 介导的基因写入是位点精准特异的，有效避免了逆转录病毒等技术所产生的基因随机整合导致的基因突变风险。

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研究结论与展望

以往研究显示，R2 逆转座子具有以 RNA 为供体的大片段基因精准写入工具开发的巨大潜力。然而，其在哺乳动物细胞中的功能性质，以及如何实现大片段功能基因的有效整合，尚未被系统性地探索。该研究首次开发逆转座子基因工程新技术，实现全 RNA 介导的基因精准写入多种哺乳动物细胞系、原代细胞中，成功发挥靶向基因整合的优势，对基因治疗和基础研究将起到至关重要的作用！

周琪，博士，研究员，中国科学院院士，发展中国家科学院院士。现任中国科学院副院长、兼任中国科学院大学党委书记、校长。曾任国家 973 计划、863 计划、国家重大科学研究计划、中国科学院干细胞领域战略性科技先导专项项目首席科学家。在动物克隆、干细胞发育全能性及调控机制、新型干细胞系创建、哺乳动物同性生殖、细胞命运决定、干细胞资源库建立、干细胞临床应用研究等方面取得多项原创性成果。在 Cell, Nature, Science 等刊物发表 SCI 论文 200 余篇，研究成果多次入选国内、国际年度科技进展。获得国家自然科学奖二等奖、中国科学院杰出科技成就奖、周光召基金会杰出青年基础科学奖、何梁何利基金科学与技术进步奖、genOway 国际转基因技术奖、发展中国家科学院（TWAS）生物学奖等科技奖励。

李伟，博士，研究员，博士生导师，干细胞与生殖生物学国家重点实验室副主任。2006 年获武汉大学理学学士学位，2012 年获中国科学院大学理学博士学位。2013 年入选中国科学院动物研究所「星辰研究员」计划并建立课题组，2016 年评估优秀转任研究员。主要从事基因工程和干细胞等创新生物技术的研发，并利用这些新技术和模型揭示哺乳动物生殖与再生的基础调控规律，开发重大疾病的基因治疗。作为通讯/共同通讯作者在 Science、Nature、Cell 等刊物发表论文 50 余篇。获授权发明专利 20 余项。获得国家杰出青年科学基金、优秀青年科学基金、日本实验动物学会「国际奖」、中国科学院「青年科学家奖」、中国科学院杰出科技成就奖（突出贡献者）、中国科学院朱李月华优秀教师奖等资助和奖励。

研究领域：基因组信息及其表达调控是生命多样性和复杂性的重要基础，也是疾病治疗和健康干预的重要靶标和手段。结合基因工程、细胞工程和合成生物学等手段建立新的基因工程技术和细胞/动物模型，用于（1）揭示生殖与再生相关性状及其种间进化差异的调控机制；（2）设计和制造功能定制化的细胞；（3）重大疾病的基因治疗。

参考文献：

Yangcan Chen.All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons.2024.