酶免ELISA基本知识及检测原理

一、酶免检测原理：

        酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行

的，反应结果以颜色显示， 通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中

待测抗体或抗原的浓度

二、酶免应用场景：

广泛地应用在临床检验、 生物学研究、 农业科学、 食品和环境科学中，

特别在近几年中， 由于大量的酶联免疫检测试剂盒的应用， 使得酶标仪在生殖保

健领域中应用越来越广泛，同时促进了生殖健康技术水平提高。

三、酶免检测项目：

1.乙肝五项

2.爱滋病检测

3.优生优育系列检测

4.激素检测

四、目前酶免国内主要应用的技术：

        目前国内常见的 ELISA 试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化

物酶（HRP），底物通常为四甲基联苯胺（ TMB ）和邻苯二胺（ OPD），其在

过氧化氢溶液的存在下，经 HRP 作用，分别氧化为 2,2,-二氨基偶氮苯（ DAB）

和联苯醌。当 pH 值为 5.0 左右时，DAB 在 450nm 波长处有最大吸收，当 pH 值

降为 L 0 时，最大吸收波长移至 492 nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，因

而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 TMB 的氧化产物联苯醌在波长 450nm 处有

最大消光系数，如果 HRP 量少，H:O:和TMB 过量时，则形成蓝色的阳离子根。

降低 pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使

产物稳定 90min.因此，450nm和 492 nm两个波长是目前 ELISA 测定最常用的。

各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装 6~8 片滤光

片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶标仪以 490nm 滤光片替代

492nm滤光片，影响不大。除了这两个基本滤光片外， 考虑到双波长比色的需要，

还应有 620nm 或630nm 或 650nm 和405nm 波长的滤光片，其他滤光片可根据

自己的需要选择。 有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定， 故酶标仪生

产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个 340nm 波长滤光

片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为 340-750nm 或800nm。

五、酶免检测方式

酶免单波长检测：

        单波长就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定

酶免双波长检测：

        双波长则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm 或492 nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定。检测结果为两者吸光度之差。630 nm 波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA 比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。

六、工作环境：

1.仪器应放置在低于 40 分贝的环境下；

2.为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射；

3.操作时环境温度应在 15℃-40℃之间，环境湿度在 15%-85%之间。

4.操作电压应保持稳定。

5.操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。

6.保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。