酶免ELISA基本知识及检测原理

一、酶免检测原理:

        酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行

的,反应结果以颜色显示, 通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中

待测抗体或抗原的浓度

二、酶免应用场景:

广泛地应用在临床检验、 生物学研究、 农业科学、 食品和环境科学中,

特别在近几年中, 由于大量的酶联免疫检测试剂盒的应用, 使得酶标仪在生殖保

健领域中应用越来越广泛,同时促进了生殖健康技术水平提高。

三、酶免检测项目:

1.乙肝五项

2.爱滋病检测

3.优生优育系列检测

4.激素检测

四、目前酶免国内主要应用的技术:

        目前国内常见的 ELISA 试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化

物酶(HRP),底物通常为四甲基联苯胺( TMB )和邻苯二胺( OPD),其在

过氧化氢溶液的存在下,经 HRP 作用,分别氧化为 2,2,-二氨基偶氮苯( DAB

和联苯醌。当 pH 值为 5.0 左右时,DAB 450nm 波长处有最大吸收,当 pH

降为 L 0 时,最大吸收波长移至 492 nm,同时摩尔消光系数变大,显色加深,因

而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 TMB 的氧化产物联苯醌在波长 450nm 处有

最大消光系数,如果 HRP 量少,H:O:TMB 过量时,则形成蓝色的阳离子根。

降低 pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌,使用硫酸作为终止剂可使

产物稳定 90min.因此,450nm 492 nm两个波长是目前 ELISA 测定最常用的。

各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件,可以同时安装 6~8 片滤光

片,所配备的滤光片均应包括上述两个波长,有的酶标仪以 490nm 滤光片替代

492nm滤光片,影响不大。除了这两个基本滤光片外, 考虑到双波长比色的需要,

还应有 620nm 630nm 650nm 405nm 波长的滤光片,其他滤光片可根据

自己的需要选择。 有时,有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定, 故酶标仪生

产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能,此时需要一个 340nm 波长滤光

片。此时,酶标仪的测定波长范围就成为 340-750nm 800nm

五、酶免检测方式

酶免单波长检测:

        单波长就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm492 nm进行比色测定

酶免双波长检测:

        双波长则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm 492 nm进行比色测定外,同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定。检测结果为两者吸光度之差。630 nm 波长下得到的吸光度是非特异的,来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此,在ELISA 比色测定中,最好使用双波长,且不必设空白孔。

六、工作环境:

1.仪器应放置在低于 40 分贝的环境下;

2.为延缓光学部件的老化,应避免阳光直射;

3.操作时环境温度应在 15-40之间,环境湿度在 15%-85%之间。

4.操作电压应保持稳定。

5.操作环境空气清洁,避免水汽,烟尘。

6.保持干燥、干净、水平的工作台面,以及足够的操作空间。

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