细胞培养常见问题分析

1、冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？
除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同的培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同的血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5、何谓 FBS,FCS,CS,HS ?

	FBS(fetal bovine serum)和 FCS(fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指*胎牛血清*，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum)则是指*小牛血清*。HS(horseserum)则是指*马血清*。

6、培养细胞时应使用 百分之五 或 百分之十的CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+作为 pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7g 时，细胞培养时应使用百分之十的CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时，则应使用百分之五 的CO2 培养细胞。
7、何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
8、培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05百分之五 trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于*–20 ℃*，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

10、悬浮性细胞应如何继代处理？

	一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，*稀释细胞浓度*即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)，5-10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
12、细胞的接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基的成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和 90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
14、DMSO等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用的DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4°C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一:冷冻管置于 4℃30-60 分钟→(-20℃30 分钟*)→-80℃ 16-18 小时(或隔夜)→液氮槽 vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1-3℃ 至–80℃以下，再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。
20℃不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入*-80℃* 冰箱中， 惟存活率稍微降低一些。

15、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

	冷冻管内细胞数目一般为 *1x10^6*cells/ml vial，融合瘤细胞则以 *5x106* cells/ml vial 为宜。

16、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。
18、支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
19、支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

20、CO2 培养箱的水盘如何保持清洁？

	定期(至少*每两周一次*) 以*无菌蒸馏水或无菌去离子水更换*之。

21、为何培养基保存于 4℃冰箱中，颜色会偏暗红色，且 pH 值会越来越偏碱性？
培养基保存于 4℃冰箱中，培养基内之 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为 phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之 CO2，以调整 pH 值。
22、各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？
不同厂牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。
23、购买的细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少的情形？购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当， 造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。

25、如何选用特殊细胞系培养基？

	培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，*首选 MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始*，各种目的无血清培养最好*首选 AIM V（12005） 培养基（SFM）*。

26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
27、GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定，即使在 121 摄氏度灭菌 20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
28、什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色， 碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么？

	 二价离子的确*抑制胰蛋白酶活性*。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持*抑制胰蛋白酶的活性*。建议胰蛋白酶处理细胞前，用 EDTA 清洗细胞， 以*消除*来自培养基中所有的*二价离子*。

31、Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要 CO2 培养箱，原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和 Earle‘s 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在 Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡，以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液会变碱，Hanks 液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织，需要用 Eagles 液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用 Hanks 液就可以了。