流式细胞术及常见问题分析

　　目前，流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与特定细胞分子结合的蛋白或配体，如与 DNA 结合的溴化丙啶 (PI) 等。

 

　　染色步骤包括：将培养的细胞或组织样品制成单细胞悬液，然后将细胞放入管子或酶标板中与荧光标记或未标记的抗体孵育。之后将细胞放入流式细胞仪中进行分析。

 

　　悬浮缓冲液中染色的细胞样品通过流式细胞仪时，由于鞘液的作用被限制在液流的轴线上，从而通过一个非常小的喷嘴。这种微小的“流液束”使细胞一个接一个地通过激光，细胞/粒子通过通道时散射的光线被多个探测器检测到。其中光柱前有一个检测器（称为前向角散射或简称 FSC），它的旁边有几个检测器（称为侧向散射或简称 SSC）。荧光检测器用于检测荧光染料本身。粒子/细胞通过光束时，将出现光线散射，散射会通过前向散射和侧向散射被检测到。散射和荧光数据会结合起来分析。其中前向角散射光与细胞的大小有关；而侧向角散射则依赖于粒子/细胞的密度（比如胞浆颗粒数量，细胞膜尺寸），并往往以这种方式，根据不同的大小和密度的差异而将细胞群区分开来。当由相应激发波长的激光激发时，用于检测或染色的荧光染料就会发光。这些粒子/细胞就可分别被检测并进行数据分析。

 

直接染色：

 

　　直接免疫荧光染色时，细胞与直接结合有荧光染料（如 FITC 标记）的抗体孵育。它的优点在于只需要抗体孵育这一个步骤，从而消除了来自二抗的非特异性结合的可能性。这对细胞内染色特别有用，由于大的抗体荧光分子复合物包括二抗被困在细胞内造成背景，或甚至无法进入细胞，阻止了一抗的检测。

 

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